ESERCIZI di BIOLOGIA MOLECOLARE A.A 2004-2005

Il plasmide pNEB è una molecola di DNA circolare di 2713 bp. ESERCIZIO n°1 Il plasmide pNEB è una molecola di DNA circolare di 2713 bp. La soluzione ottenuta dopo il processo di purificazione presenta il seguente spettro di assorbimento nell’UV visibile: A l(nm) 0,25

Qual è la concentrazione MOLARE della soluzione Qual è la concentrazione MOLARE della soluzione?(d=cammino ottico=0,3 cm) [C=30,7 X 10 –9 M=30,7 nM] 2) Qual è la concentrazione in ng\ml? [C=55 ng\ml] Considerando che per la misura allo spettrofotometro, 5ml della soluzione originaria sono stati diluiti in 95 ml di acqua, qual è la concentrazione molare della soluzione originaria? [C=614 X 10 –9 M=614 nM; C=1,1 mg\ml] Quale sarebbe stata l’Assorbanza osservata se la misura fosse stata eseguita sulla soluzione originaria? [ A = 4,99] Considerando che il volume della soluzione originaria rimasta è 30 ml, quanti mg totali di DNA abbiamo? [DNATOT= 33 mg]

ESERCIZIO n°2 Avendo 815 ·10-6 g. di u oligonucleotide a singolo filamento (primer) lungo 24 nt, in quanti ml di acqua è necessario scioglierli per ottenere una soluzione 100 mM? [V=1029 ml=1,3 ml] Diluiamo 1 ml della soluzione in 99 ml di acqua. Quale risulterà l’assorbanza a l=260 nm di tale soluzione? [ A=0,24] ESERCIZIO n°3 Il Servizio di Sequenziamento richiede per eseguire la reazione 500 ng. di campione da sequenziare 6,4 pmol dell’oligonucleotide utilizzato come primer. 1)Quanti ml di una soluzione 125 nM di un plasmidio lungo 3215 bp da sequenziare devo inviare? [ 1,88 ml ] 2)Quanti ml di oligonucleotide 10 mM? [ 0,64 ml ]

ESERCIZIO n°4 Quanto misura la lunghezza in nm di una molecola di DNA lineare in forma B costituita da 9824 bp? [ L=3340,16 nm=3,34 mm ] Quanti giri di elica contiene? [n°giri=982] Se la stessa molecola viene posta in alcool, quindi in condizioni di scarsa umidità, quale modificazione strutturale interviene? [forma A] Di quanto varieranno lunghezza in nm e numero di giri dell’elica? [L=2515 nm=2,515 mm ; n° giri=893] ESERCIZIO n°5 Qual è il peso molecolare (PM) di una molecola di DNA ds (double strand)di 3421 bp? [PM= 2257869 Da] Quale invece il peso molecolare di un singolo filamento di DNA di 1750 nucleotidi? [PM=577500 Da] ESERCIZIO n°6 Se una soluzione contenente tre frammenti di DNA lunghi rispettivamente 1600 bp, 650 bp e 1105 bp, viene sottoposta ad elettroforesi su gel di agarosio, quale sarà, a partire dal polo positivo, l’ordine delle bande osservate al termine della corsa?

Il peso molecolare di una molecola di DNA a doppio filamento è: PM= 660 x nro bp DA DOVE DERIVA IL VALORE “660”? è il peso molecolare di una coppia di basi, quindi la metà, 330, corrisponde al peso molecolare di un nucleotide. Poiché il DNA è costituito da quattro nucleotidi diversi, tale valore rappresenta un VALORE MEDIO C5H10O4 PM=130 PO3 PM=78 PM=111 PM=126 PM=135 PM=150 PMmedioBASI=130 PMmedioNUCLEOTIDE 330

Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [2] ESERCIZIO n°7 Un plasmide di 3000 bp viene sottoposto ad una serie di restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati con gel-elettroforesi: BamHI EcoRI BamHI EcoRI Kb Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [2] Quanti siti di restrizione ha BamHI? [2] Quali sono le distanze reciproche tra i siti? Disegnare la mappa di restrizione.

Quanti siti di restrizione ha PvuII?A quale distanza reciproca? ESERCIZIO n°8 Un plasmide di 6000 bp viene sottoposto ad una serie di restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati con gel-elettroforesi: Digestioni singole Kb PvuII EcoRI BamHI SapI Quanti siti di restrizione ha PvuII?A quale distanza reciproca? [ 3 siti posti a 2000 bp uno dall’altro] 2) Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [1] 3) Quanti siti di restrizione ha BamHI? [1] 4) Quanti siti di restrizione ha SapI? [1]

Quali sono le distanze reciproche tra i siti di restrizione? Digestioni doppie BamHI PvuII SapI BamHI PvuII EcoRI PvuII SapI SapI EcoRI EcoRI BamHI Kb Quali sono le distanze reciproche tra i siti di restrizione? Disegnare la mappa di restrizione.

Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [1] ESERCIZIO n°9 Un frammento di DNA lineare lungo 5000 bp viene sottoposto ad una serie di restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati con gel-elettroforesi: BamHI EcoRI BamHI EcoRI Kb Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [1] Quanti siti di restrizione ha BamHI? [1] Quali sono le distanze reciproche tra i siti? Disegnare la mappa di restrizione del frammento.

Quanti siti di restrizione ha BamHI? [2] ESERCIZIO n°10 Il plasmide A, lungo 4000 bp viene tagliato con BamHI e il risultato della restrizione viene visualizzato tramite gel-elettroforesi: BamHI Kb Quanti siti di restrizione ha BamHI? [2] Qual è la loro posizione reciproca? [1000 bp di distanza] Supponiamo di recuperare e purificare il frammento di restrizione più lungo. Avendo digerito 4 mg di plasmide A, se al termine della purificazione del frammento di 3000 bp, la soluzione ottenuta presenta una A260nm=0,4, quanti ng di DNA sono stati persi nei vari passaggi rispetto alla resa teorica? [ DNA perduto=1260 ng]

1) Quale sarà la lunghezza in bp del nuovo costrutto? [3178 bp] Il frammento di 3000 bp viene utilizzato come vettore di clonaggio per l’inserzione di un frammento di DNA di 178 bp ottenuto a sua volta da un secondo plasmide per restrizione BamHI-NdeI. 1) Quale sarà la lunghezza in bp del nuovo costrutto? [3178 bp] 2) Quale sarà il risultato di una successiva digestione del nuovo costrutto con BamHI? [il costrutto circolare viene linearizzato] 3)Nella reazione di ligazione, vettore e inserto devono essere miscelati in rapporto molare 1:3; utilizzando 100 ng di vettore, quanti ng di inserto sono necessari? [quantità inserto=17,62 ng] Se la soluzione dell’inserto di 178 bp a disposizione presenta lo spettro di assorbimento nell’UV visibile rappresentato in figura, quanti ml ne devono essere utilizzati? [V= 0,5 ml] A l(nm) 0,15

ESERCIZIO n°11 Dobbiamo preparare 50 ml di un buffer di trascrizione(10X) così costituito: 500 mM KCl 200 ml Tris-HCl 50 mM MgCl2 Avendo a disposizione i seguenti stock concentrati Tris-Hcl 1M KCl 2M MgCl2 1M Quanti ml di ciascuno stock devono essere utilizzati?[KCl 12,5 ml;Tris-HCl 10 ml; MgCl2 2,5 ml; si aggiungono 25ml di acqua] Considerando che il volume di ciascuno stock è 25 ml e che le tre sostanze hanno i seguenti PM KCL PM=74,56 uma MgCl2 PM=203.32 uma Tris-HCl PM=157.64 uma quanti g. di ciascuna sostanza sono stati pesati per preparare i tre stock? [KCl g. 3,728;MgCl2 g. 5,083;Tris-HCl g. 3,941] Quanti g. di ciascuna sostanza sarebbero serviti per preparare il buffer direttamente dalle polveri?[KCl g.1,864;MgCl2 g. 0,5; Tris-HCl g. 1,576]

ESERCIZIO n°12 Per ottenere un frammento di DNA di 850 bp, esso viene amplificatotramite PCR e gel purificato. Si allestiscono 4 reazioni di PCR, ciascuna avente un Volume di 50 ml. Considerando che a PCR ultimata la concentrazione di DNA n soluzione è in ciascun tubo 10 ng\ml e che l’efficienza della procedura di gel purificazione è del70 %, quale sarà la concentrazione molare dei 50 ml di soluzione finale ottenuti?Quanti mg. totali di DNA si ottengono?[c=50x 10-9M =50 nM;mg.DNA 1,4]

ESERCIZIO n°13 La corsa elettroforetica di tre campioni contenenti frammenti di DNA ha fornito il seguente risultato: 1 2 3 Determinare la lunghezza in bp e il peso molecolare dei frammenti contenuti in ciascun campione. [1:544bp; 2:1480 bp ;3: 221 bp] La corsa elettroforetica di molecole si dimensioni diverse va linearmente con il LOGARITMO del peso molecolare

n° bp ln n°bp Distanza(mm) 1857 7,5 0,75 1058 6,96 2,7 929 6,83 3,2 383 5,94 6,28 121 4,79 9,05