Programmi di sequenziamento genomico nelle piante Arabidopsis Riso Pioppo Già completati Mais Pomodoro Soia ……etc.

Analisi funzionale dei geni Mutagenesi inserzionale RNA Antisenso RNAi (Knock out) Diminuire l’espressione

Mutagenesi inserzionale Mutagenesi inserzionale su larga scala

T-DNA tagging Trasposon tagging

Il trasferimento genico nelle piante Mediato da: Vettore biologico: Agrobacterium, virus Diretto: biolistico, microiniezione, etc

Agrobacterium tumefaciens e rhizogenes

Agrobacterium tumefaciens E’ un patogeno delle piante responsabile del tumore (la galla) La trasformazione delle cellule della pianta è conseguenza del trasferimento e dell’integrazione nel genoma nucleare della cellula target di una regione (T-DNA) del plasmide Ti (Tumor-inducing)

L’integrazione del T-DNA nel genoma dell’ospite è casuale

Trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens plasmide helper Trasforma senza indurre il tumore (disarmato) NOS-pro NOS-t NPTII(KanR) CaMV35S gene X Vettore a T-DNA RB LB

Piantine trsformanti (verdi; KanR) di Arabidopsis thaliana Presunti trasformanti (gdhAsenso N.plumba) di Arabidopsis thaliana a due settimane dalla semina su terreno selettivo ( ½ MS- NH4 + suc 0.5% + kanamicina 50 g/ml + cefo + carb). Seconda trasformazione (Silwet); semina del 21/7/06. Piantine trsformanti (verdi; KanR) di Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana (pianta modello) il cui genoma è stato completamente sequenziato ( 2000) 225.000 linee inserzionali (T-DNA) Arabidopsis Biological Stock Center (Ohio S.U.) Nothingham Arabidopsis stock center (NASC) Breve sequenza del DNA genomico fiancheggiante l’inserto permette di stabilirne la posizione nel genoma

Trasposoni

Barbara McClintock (1902 –1992) Ds dissociation (non autonomo); Ac Activator (autonomo)

Ac: 4563 bp IR : sequenze ripetute (imperfette) terminali 11bp Un gene che codifica per la trasposasi (807 aa)

Individuare, clonare e caratterizzare geni (anche su larga scala) Come può essere utilizzato il trasposon (e T-DNA tagging) la sequenza del genoma: è disponibile Assegnare una funzione ai geni non è disponibile Individuare, clonare e caratterizzare geni (anche su larga scala)

Trasposizione generalizzata Mu (mais) (tutto il genoma) Trasposizione “bersaglio” specifica Ac/Ds (una regione genomica)

Mu (mutator) 70-90% degli elementi Mu si inserice nei geni le inserzioni si verificano tardivamente nelle cellule germinali si inseriscono con alta frequenza sia in loci associati che non associati e qui rimangono stabili e trasmissibili attraverso la linea germinale non vengono persi e continuano a replicarsi (saturation mutagenesis)

Elemento Mu

Rescue Mu Consiste in un plasmide inserito in un elemeto Mu non autonomo

pBluescript: plasmide batterico ad alto numero di copie Lc (Leaf color): fattore trascrizionale richiesto per la prod. antocianine viene cotrasformato con pAHC20 (resistenza al Basta) le linee cotrasformate devono esser incrociate con una linea che porta un MuDr attivo per potere trasporre.

Rescue Mu Accelerare la scoperta e la caratterizzazione di geni mutagenizzati con Mu che presentino un fenotipo di interesse Recupero del plasmide 5-20 Kb di DNA, fiancheggiante l’elemento Mu, in forma plasmidica facilmente sequenziabile (non occorre costruire una libreria genomica del mutante)

Non solo inserzioni germinali, ma anche somatiche tardive (cellule della foglia) Difficilmente danno un fenotipo e difficilmente vengono trasmesse alla progenie Una nuova risorsa per costruire librerie batteriche di DNA genomico di Mais arricchito in sequenze eucromatiche