Determinare il tropismo virale Test TROFILE™ (Monogram Biosciences) Questa sezione della presentazione illustra: Come usare il test TrofileTM (Monogram Biosciences Inc., San Francisco) per determinare il tropismo del co-recettore dell’HIV. Perché il test TrofileTM non è in grado di distinguere fra popolazioni di virus a tropismo duplice e a tropismo misto.

TrofileTM: Virus R5 CD4 CCR5 CD4 CCR5 CD4 CXCR4 CD4 CXCR4 R5 X4 R5/X4 luc gag pol env Transfezione Infezione CD4 CXCR4 CD4 CCR5 Vettore di espressione (luciferasi) env gag pol luc gag pol Library del vettore di espressione env CD4 CXCR4 La tecnologia del test TrofileTM utilizza un vettore di espressione per trasportare l’intera sequenza di codificazione dell’envelope dell’HIV amplificata dal campione in esame (indicato in rosso). Quando si analizza un campione ematico, viene creata una “library” del vettore di espressione env dell’HIV, contenente un vasto insieme di sequenze che rappresentano la diversità delle sequenze env virali del paziente al momento del prelievo. Le colture cellulari vengono transfettate con la libreria del vettore di espressione dell’env purificato e con un altro vettore HIV-1 standardizzato privo della regione di codificazione dell’env, ma contenente il gene della luciferasi (indicato in giallo). [Fare clic per proseguire con l’animazione] Ciò produce particelle di pseudovirus incapaci di replicazione che trasportano glicoproteine dell’env derivate dal virus del paziente. L’infezione delle colture cellulari di CD4+ da parte di questi pseudovirus produce luciferasi. [Fare clic per proseguire con l’animazione] La capacità degli pseudovirus di infettare le cellule bersaglio CD4+ che esprimono il CCR5 o il CXCR4 viene quindi misurata in base all’attività della luciferasi. Una popolazione virale composta unicamente da virus R5, come in questo esempio, produrrà il segnale della luciferasi solo sulle cellule che esprimono il co-recettore CCR5. [Fare doppio clic per proseguire con l’animazione] Questa popolazione virale può essere classificata come R5 e quindi il referto TrofileTM risponde “sì”: un farmaco CCR5 antagonista può essere adatto per questo paziente. Bibliografia Whitcomb J, Huang W, Fransen S, et al. Development and characterization of a novel single-cycle recombinant-virus assay to determine human Immunodeficiency virus type 1 coreceptor tropism. Antimicrob Agents Chemother 2007;51:566-575. Infezione Transfezione Aggiunta di inibitori di entrata per confermare il tropismo R5 X4 R5/X4 (duplice) Whitcomb J, et al. Antimicrob Agents Chemother 2007;51:566-575 1/9/2007 - 730pm eSlide - P3591 - Template - Blue - No Logo

Risultato del test TrofileTM che indica un virus R5 CD4 CCR5 R5 X4 R5/X4 (duplice) luc gag pol env vettore di espressione (luciferasi) Libreria del vettore di espressione env Transfezione Infezione CD4 CXCR4 Aggiunta di inibitori di entrata per confermare il tropismo Risultato del tropotipo R5 D/M X4 Il virus utilizza i co-recettori CCR5 per entrare nella cellula CD4+ È prevista attività CCR5 antagonista? SI NO Questa diapositiva fa parte di un’animazione: vedi note sulla diapositiva precedente. 1/9/2007 - 730pm eSlide - P3591 - Template - Blue - No Logo

TrofileTM: virus a tropismo misto CD4 CCR5 R5 X4 R5/X4 ( luc gag pol env Transfezione Infezione CD4 CXCR4 CD4 CCR5 Vettore di espressione (luciferasi) env gag pol luc gag pol Library del vettore di espressione env CD4 CXCR4 Le popolazioni virali a tropismo misto contengono un insieme di virus R5, X4, e R5/X4 (dual tropic). [Fare clic per proseguire con l’animazione, come nella diapositiva precedente] In questo caso, gli pseudovirus della popolazione mista possono produrre un segnale sulle cellule che esprimono il co-recettore CCR5 e sulle cellule che esprimono il co- recettore CXCR4. Si otterrà lo stesso identico risultato anche con una popolazione di soli virus a tropismo duplice poiché tali virus sono in grado di sfruttare sia il co- recettore CCR5 sia il CXCR4 per entrare nelle cellule portatrici dell’antigene CD4. Di conseguenza, quando si esegue il test su un’ampia popolazione di virus, un segnale positivo sia sulle cellule che esprimono CCR5, sia su quelle che esprimono CXCR4, può indicare una popolazione virale a tropismo duplice oppure una popolazione mista di virus R5 e X4. Per distinguere una popolazione virale effettivamente a tropismo duplice da una a tropismo misto bisognerebbe testare molti singoli cloni di virus. [Fare clic per proseguire con l’animazione] In questo caso, il referto TrofileTM indica il virus del paziente come a tropismo duplice/misto (D/M): i CCR5 antagonisti non ridurrebbero significativamente la carica virale in questo paziente. Bibliografia Whitcomb J, Huang W, Fransen S, et al. Development and characterization of a novel single-cycle recombinant-virus assay to determine human Immunodeficiency virus type 1 coreceptor tropism. Antimicrob Agents Chemother 2007;51:566-575. Infezione Transfezione Aggiunta di inibitori di entrata per confermare il tropismo R5 X4 R5/X4 (duplice) Whitcomb J, et al. Antimicrob Agents Chemother 2007;51:566-575 1/9/2007 - 730pm eSlide - P3591 - Template - Blue - No Logo

Risultato del test TrofileTM che indica un virus a tropismo duplice/misto CD4 CCR5 R5 X4 R5/X4 (dual) Aggiunta di inibitori di entrata per confermare il tropismo luc gag pol env Vettore di espressione Luciferasi Libreria del vettore di espressione env Transfezione Infezione CD4 CXCR4 Risultato del tropotipo D/M R5 X4 La popolazione virale doppia/mista può usare i co-recettori CXCR4 e/o CCR5 per entrare nella cellula CD4+. Infettività da X4 vicina al limite di rilevamento. I risultati del tropismo determinati vicini al limite del rilevamento possono essere variabili su test successivi del campione. Attività dell’antagonista CCR5 prevista? SI NO Questa diapositiva fa parte di un’animazione: vedi note sulla diapositiva precedente. 1/9/2007 - 730pm eSlide - P3591 - Template - Blue - No Logo

Riassunto delle caratteristiche del test TrofileTM Prestazione Tempo totale richiesto1 Da 3 a 4 settimane (2 per il test, più circa 1-2 settimane per il trasporto e i risultati) Sensibilità del test in base alla carica virale* ≥1.000 copie/mL (95,4%; n= 104/109)2 Campioni esaminati fino ad oggi Oltre 23.000 In questa diapositiva sono riassunte le principali caratteristiche di performance del test TrofileTM. Il test TrofileTM permette di identificare il tropismo dei pazienti e stabilire se maraviroc sia un trattamento adatto al paziente.1 Le sottopopolazioni virali minoritarie sono individuate in modo affidabile quando presenti con prevalenza tra il 5 e il 10%.2 • TrofileTM individua il virus X4 con sensibilità del 100% quando il 10% della popolazione virale totale è X4. 2 • TrofileTM individua il virus X4 con sensibilità del 83% quando il 5% della popolazione virale totale è X4. 2 Bibliografia 1. Whitcomb J, et al. Antimicrob Agents Chemother 2007;51:566-575 2. CHMP Assessment Report for Celsentri (International Nonproprietary Name: maraviroc); Procedure No. EMEA/H/C/000811. London, 17 July 2007, Doc. Ref.: EMEA/CHMP/143949/2007 * Proporzione dei campioni con risultati in termini di tropismo al dato livello di HIV-1 RNA; n: campioni positivi (numeratore) e valutati (denominatore). 1. Whitcomb J, et al. Antimicrob Agents Chemother 2007;51:566-575 2. CHMP Assessment Report for Celsentri (International Nonproprietary Name: maraviroc); Procedure No. EMEA/H/C/000811. London, 17 July 2007, Doc. Ref.: EMEA/CHMP/143949/2007 1/9/2007 - 730pm eSlide - P3591 - Template - Blue - No Logo

eSlide - P3591 - Template - Blue - No Logo Sintesi (1) CCR5 e CXCR4 sono i principali co-recettori delle chemochine che l’HIV utilizza per entrare nelle cellule CD4. Di conseguenza, il tropismo virale viene descritto come R5, X4 (per i virus in grado di sfruttare sia uno che l’altro o entrambi i co-recettori) oppure come D/M (duplice/misto). I dati recenti che dimostrano l’utilità clinica dei CCR5 antagonisti, insieme alla disponibilità del test TrofileTM, che può determinare il tropismo virale (tropotipo) di un paziente con infezione da HIV-1, possono ampliare e incrementare le possibilità del medico di costruire dei regimi antiretrovirali ottimali. 1/9/2007 - 730pm eSlide - P3591 - Template - Blue - No Logo

eSlide - P3591 - Template - Blue - No Logo Sintesi (2) Il test TrofileTM è facile da somministrare e da interpretare. Il test ha un tempo di “turn-around” di 2-3 settimane. Il referto fornisce al medico una semplice risposta “sì” o “no” circa la probabile efficacia di un CCR5 antagonista, stimata in base al tropotipo del paziente. Nei pazienti già trattati con ARV e infettati solo con ceppi HIV R5, gli studi clinici hanno dimostrato, con l’aggiunta di un CCR5 antagonista alla OBT, un miglioramento statisticamente significativo del controllo virale e un aumento della conta delle cellule CD4 a 24 settimane rispetto a OBT + placebo. Nei pazienti con HIV D/M, non è attesa una riduzione significativa della carica virale da parte dei CCR5 antagonisti; tuttavia, in questi pazienti è stato osservato un aumento delle cellule CD4-positive dopo 24 settimane. L’analisi dei pazienti arruolati negli studi clinici, che sono stati condotti su pazienti già trattati con ARV, ha dimostrato che la maggior parte di questi pazienti evidenziava solo virus R5 al momento dello screening per lo studio. Dei restanti pazienti, quasi tutti evidenziavano la presenza di ceppi virali D/M, mentre quelli con soli ceppi virali X4 non superavano il 2-4%. 1/9/2007 - 730pm eSlide - P3591 - Template - Blue - No Logo