SCIENZE NATURALI ED UMANE Ambiente fisico e biologico: interazioni con le attività umane nel passato e nel presente UNITA’ BIOMEDICA: La Microscopia applicata alle scienze biomediche, quale mezzo di studio per l’ambiente biologico.

Sommario Parte Teorica (1a lezione) 1) Il microscopio ottico come punto di partenza 2) Dal microscopio ottico al microscopio elettronico: Principi di funzionamento di TEM e SEM 3) Il microscopio confocale (CLSM): principi di funzionamento 4) Principi di immunocitochimica: metodiche di evidenziazione di molecole e strutture cellulari per l’osservazione al CLSM 5) Esempi applicativi di TEM, SEM e confocale a ricerche in campo biomedico

Scala logaritmica delle dimensioni 1mm Onde radio 100 m Limite dell’occhio umano 75 m Cellule epiteliali 40 m 10 m Infrarosso Emazie 6-7 m Limite microscopio ottico a luce bianca  1m Batteri 2m 1 m Visibile Limite microscopio ottico a luce ultravioletta 0,2-0,1m Micoplasmi 0,1-0,2 m 0,1 m (1000 ) Ultravioletto Virus 0,1-0,01m 0,01 m (100 ) Proteine 0,005-0,01m 0,001 m (10 ) Aminoacidi 8-12  Limite microscopio elettronico 4  0,0001 m (1 ) Atomi 1-4 

Il microscopio ottico come punto di partenza Un po’ di storia... Microscopio ottico semplice: 5 secoli fa Microscopio ottico composto: alla fine del 1600 ad opera dei fratelli Jonssen in Olanda e Galileo Galilei in Italia Dal 18° secolo in poi la microscopia ottica ha raggiunto livelli di grande qualità, dovuti allo sviluppo di componenti ottici e meccanici. Dalla fine 19° secolo la competizione ha permesso una produzione qualitativamente alta e a prezzi contenuti

Dal microscopio ottico al microscopio elettronico: Principi di funzionamento di TEM e SEM

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Un po’ di storia... Berlino 1931: Prof. Ernst Ruska (Nobel nel 1986), intuisce che un campo elettromagnetico funzionava come una lente per gli elettroni. 7 Aprile 1931: Ruska & coll del gruppo del Prof. Max Knoll ottengono la prima foto al micr. Elettronico (17.400 X) Nascita della Microscopia Elettronica 1933: E. Ruska sviluppa il vero prototipo di Microscopio Elettronico a Trasmissione (TEM) 1939: TEM disponibile sul mercato

Microscopio elettronico a scansione (SEM) Un po’ di storia... Tra il 1935 e 1938: M. Knoll ottiene le prime immagini relative alla topografia della superficie di un campione colpito da un fascio di elettroni. Basi per la costruzione del primo Microscopio Elettronico a Scansione (SEM). 1938: in Germania, M. von Ardenne progetta il primo strumento 1965 il SEM diventa commercialmente disponibile

Confronto tra MO, TEM e SEM Elettronico a trasmissione Elettronico a scansione Ottico

Microscopio Elettronico a Trasmissione REQUISITI DEL CAMPIONE: sezioni sottili (60-80nm) di materiale incluso in resine plastiche, oppure preparati liberi di spessore molto limitato. INFORMAZIONI OTTENIBILI: relative alla struttura interna del campione. SISTEMA ILLUMINANTE: sorgente ottenuta da un filamento di tungsteno riscaldato sotto vuoto. Il fascio elettronico originato viene focalizzato sul campione mediante lenti elettromagnatiche. SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: l’immagine della zona osservata viene ottenuta in modo simultaneo su di un apposito schermo fluorescente sotto il campione. LIMITE DI RISOLUZIONE: in relazione ai parametri di osservazione scelti può essere molto elevato: 0,2-0,3nm.

Modificazioni subite da un fascio elettronico primario che interagisce con un materiale DIFFUSIONE ANELASTICA (e- - e- orbitale esterno atomo): Diminuzione di energia senza apprezzabile perdita di direzione. DIFFUSIONE ELASTICA (e- - nucleo atomico): Variazione di direzione senza apprezzabile perdita di energia.

Segnali emessi da un campione biologico colpito da un fascio di elettroni Elettroni Secondari (SE) fascio di elettroni primario - e- orbitali esterni. Bassa energia  50 eV. Informazioni da stati superficiali (10nm) MORFOLOGIA DI SUPERFICIE Elettroni Retrodiffusi o backscattered (BSE) urti elastici Energia  50 eV. Informazioni di tipo compositivo o morfologico di strati profondi (alcuni m. Catodoluminescenza presenza di sostanze luminescenti Radiazioni X emissione di SE da orbitali interni: a seconda dello spettro di r. X emesse si può risalire agli elementi costituenti il campione (MICROANALISI)

Microscopio Elettronico a Scansione REQUISITI DEL CAMPIONE: frammenti di materiale da pochi mm3 sino all’ordine di cm3 (per i campioni biologici, da cellule in coltura a frammenti di tessuti). INFORMAZIONI OTTENIBILI: relative, nella modalità principale di osservazione, alla superficie del campione, con la formazione di immagini di aspetto tridimensionale. SISTEMA ILLUMINANTE: stessa sorgente del TEM SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: non esistono lenti magnetiche al di fuori di quelle utilizzate per la focalizzazione del fascio. L’immagine viene ottenuta sulla superficie di un tubo a raggi catodici, mediante elaborazione elettronica del segnale proveniente dal campione. LIMITE DI RISOLUZIONE: in relazione ai vari parametri di osservazione scelti può essere da 5 a 30nm.

Elettronico a trasmissione Studi ultrastrutturali ed alterazione delle strutture interne di cellule o tessuti in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici degli stessi Localizzazione di molecole interne a cellule o tessuti preventivamente marcati Osservazione di virus Elettronico a scansione Morfologia di superficie ed alterazioni della stessa in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici di cellule o tessuti Localizzazione di recettori di superficie preventivamente marcati

Il microscopio confocale (CLSM): principio di funzionamento

Microscopio Confocale Laser (CLSM) REQUISITI DEL CAMPIONE: tecnologia non invasiva, consentendo l’osservazione del preparato a pressione ambiente, è ideale per lo studio di campioni biologici viventi (es. cellule in coltura) rendendo accessibile lo studio dinamico dei fenomeni vitali. Inoltre, sono osservabili tutti i campioni i cui componenti, strutturali e non, siano stati in qualche modo “colorati “ con sostanze o capaci di emettere luce colorata se colpite da un raggio laser (fluorocromi) od in grado di deviare il laser stesso (es. atomi ad alto peso molecolare come oro, argento, platino, cadmio) INFORMAZIONI OTTENIBILI: relative alla distribuzione, nell’intero volume del campione (sia esso un frammento di tessuto o cellule in coltura) di componenti strutturali e non dello stesso capaci di emettere, da soli od in seguito ad opportune colorazioni, un segnale luminoso quando colpito da un raggio laser. SISTEMA ILLUMINANTE: una sorgente di luce laser costituita da una miscela di gas tale da generare raggi luminoso nell’intero spettro della luce viusibile od ultravioletta. SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: l’immagine viene ottenuta sulla superficie di un tubo a raggi catodici, mediante elaborazione elettronica del segnale proveniente dal campione. LIMITE DI RISOLUZIONE: circa 0,2m

Il laser: la sorgente luminosa Si utilizzano lasers a gas ionizzato e ciascun tipo di laser ha delle linee di emissione per un limitato numero di . Tipi di lasers: ARGON Blu (488nm) e Verde (514nm) He-Ne Verde (543nm) e Rosso (633nm) KRIPTON Giallo (568nm) e Rosso (647nm) ARGON ad alta potenza Ultravioletto  < 400nm ELIO-CADMIO Necessitano di un sistema di raffreddamento liquido (molto costosi)

Microscopio Confocale Laser (CLSM) Vantaggi Informazioni relative ai vari piani focali del campione (informazioni di profondità) Maggiore nitidezza delle immagini Struttura tridimensionale del campione

Microscopio confocale laser Localizzazione di molecole autofluorescenti o marcate con sonde fluorescenti Visualizzazione di strutture cellulari (es. citoscheletro) Osservazioni sul ciclo cellulare (marcatura del nucleo con opportuni coloranti fluorescenti) Apoptosi

Sommario Parte Teorico-pratica (2a lezione) 1) Cenni introduttivi per la preparazione di campioni per TEM e SEM 2) Osservazione diretta di campioni biologici al SEM 3) Passaggi fondamentali per la preparazioni di campioni biologici per il SEM 4) Colorazioni citologiche per l’osservazione al microscopio ottico

Fasi principali della preparazione di campioni per la Microscopia Elettronica a Trasmissione ed a Scansione 1) Prelievo Particolare cura nell’evitare traumatizzazioni della zona da esaminare Il campione ottimale deve avere le minime dimensioni richieste per attuare un’adeguata fissazione, disidratazione ed inclusione in resina Delicata pulizia del campione con soluzione fisiologica o tampone Le suddette operazioni devono essere eseguite in tempi brevi

2) Fissazione Ha lo scopo di immobilizzare tutti i componenti molecolari e macromolecolari dell’architettura cellulare, provocando l’arresto istantaneo di tutte le attività chimico-fisiche cellulari Tipi di fissativi (+ usati): a) GLUTERALDEIDE 2-4%  reticola le proteine b) TETROSSIDO DI OSMIO 1-2%  fissa lipidi e proteine I fissativi sono veicolati da un opportuno tampone. Principali tamponi: a) Tampone fosfato (+ usato); b) Tampone cacodilato (sodio metil arsenato); c) Tampone veronal-acetato (altamente tossico)

3) Disidratazione Trasmissione Scansione Ha lo scopo di allontanare completamente i fluidi presenti nel campione, per poterlo poi sottoporre ai procedimenti di inclusione (trasmissione), ricopertura (scansione) e osservazione sotto vuoto. Passaggi: Etanolo 50% 10min “ 70% 10min “ 85% 10min “ 90% 10min “ 95% 10min “ 100% 2x20min Trasmissione Scansione

4a) Inclusione in resina Trasmissione 4a) Inclusione in resina La resina fornisce il sostegno necessario per tagliare il campione in fettine sottili. Si effettua un’impregnazione nei monomeri resinosi (fluidi) che verranno successivamente polimerizzati e resi solidi. Passaggi: Etanolo 100% + Acetone assoluto (1:1) 15min Acetone assoluto (rischiarante, miscibile con le resine) 15min Resina + Acetone (1:1), 24h Resina pura 24-48h Resina da inclusione 3-4gg in stufa a 70°C

Trasmissione Osservazione al TEM 5a) Taglio con ultramicrotomo 2 Tipi di sezioni: A) Semi-fine  ottico, colorandole con blu di metilene, spessore 1-2m B) Fine  elettronico, spessore 400-600nm (0,4-0,6m) 6a) Contrasto Mediante applicazione di soluzioni saline di elementi ad elevato peso atomico (Acetato di uranile e citrato di piombo) Osservazione al TEM

Scansione Osservazione al SEM 4b) Critical Point Drying 5b) Montaggio Completa la disidratazione del campione, permettendo di mantenere il più possibile inalterata la superficie del campione Passaggi: Etanolo assoluto + Acetone assoluto (1:1) 15min Acetone assoluto 15min CPD in CO2 liquida 5b) Montaggio Mediante vernicette colloidali costituite da elementi conduttivi (Ag, Cu, C) o nastri adesivi. Attacco del campione al substrato Assicura la conducibilità termica ed elettrica 6b) Ricopertura Perché la ricopertura:  conducibilità elettrica del campione  minori effetti di carica  danneggiamento termico  emissione elettronica secondaria Osservazione al SEM

Fasi principali della preparazione di campioni per la Confocale 1) Fissazione Un fissativo ottimale deve: A) Mantenere l’antigenicità del campione B) Minimizzare la comparsa di artefatti.(es. la gluteraldeide dà origine a derivati autofluorescenti  da non usare) In genere si usa paraformaldeide (2-4%) o metanolo a freddo Antigeni di superficie: immunomarcatura e poi fissazione 2) Immunomarcatura Antigeni di superficie: immunomarcatura e poi fissazione 3) Controcolorazione, per evidenziare strutture cellulari (nucleo, citischeletro etc.)