Software usati in proteomica Università degli Studi di Perugia Corso di Laurea Interfacoltà in Biotecnologie Fondamenti di Bioinformatica e di Biologia dei Sistemi Proteomica e Metabolomica Software usati in proteomica Pier Luigi Orvietani Biotecnologie 2011-2012

Strumentazione per la cattura delle immagini VERSADOC

Tools del Versadoc tramite software

Identificazione Comparazione

Il confronto e l’analisi dei 2D Gels vengono effettuati mediante l’uso di opportuni Hardware e Software Bioinformatica 6

PDQuest Workflow Acquire the image Size and orient the image Spot identification Spot comparison and matching Data analysis Spot cutting and mass spectrometry analysis Publish results

Digital Data and Signal Intensity PDQuest converte i segnali dal campone biologico in dati digitali Ogni oggetto visualizzato dal monitor è composto da tanti piccoli pixel. Ogni pixel ha una coordinata X eY a cui corrisponde una posizione orizzontale e verticale Vi è anche un valore Z che corrisponde all’intensità del segnale del pixel

Caratterizzazione dell’intensità del segnale L’oggetto per essere visibile e quantificabile deve avere l’intensità del suo cluster di pixel maggiore di quella del background L’intensità totale di un oggetto è la somma dell’intensità di tutti i pixel che formano lo stesso oggetto L'intensità media di un oggetto è l'intensità totale diviso per il numero di pixel dell'oggetto. L‘unità dell’intensità del segnale è espressa in Densità Ottica D.O.

IMMAGINI CREATE DURANTE LO SPOT DETECTION 2-D Scan Filtered Image Gaussian Image PDQuest usa modelli Gaussiani per creare spot che possano essere precisamente identificati e quantizzati PDQuest crea spot Gaussiani rapportati tridimensionalmente per meglio evidenziare le differenze fra di loro

SPOT QUANTITY Spot Quantity è la totale intensità di un spot ben definito in un immagine del gel Spot Quantity viene calcolato mediante l’immagine Gaussiana con la seguente formula Altezza dello spot * π *σx * σy Altezza dello Spot è il picco dello spot ed è misurato in OD/ unità di immagine (IU) 1 IU: 0,1 mm σx σy è la deviazione standard della distribuzione Gaussiana dello spot secondo gli assi X e Y . Anche queste sono misurate in IU Spot Quantity viene espresso in OD*IU2

L’IMMAGINE VIENE IMPORTATA E VISUALIZZATA

L’Immagine viene regolata nelle sue caratteristiche di luminosità, contrasto, gamma etc.

Una volta elaborata viene tagliata e dimensionata

via software vengono individuati gli spots, dai più deboli ai più intensi 17

Il software confronta i vari gels, evidenziando gli spots (proteine) presenti o assenti nell’uno o nell’altro. 25

Normalizzazione dei dati Formula di Normalizzazione Raw spot quantity * Scaling factor * pipette error compensation factor __________________________________________________ Normalization factor Raw spot quantity è l’intensità dello spot Scaling factor è il valore con cui noi vogliamo esprimere l’intensità normalizzata (PPM ;%)

Normalizzazione dei dati Ciò è importante perché possiamo avere errori dovuti a: Errori di prelevamento del campione Diversa colorazione per diversi tempi di contatto Campione può essere perso durante il caricamento Acquisizione diversa dovuta ad una diversa energia della sorgente Tempi di esposizione non ottimale per l’acquisizione delle immagini Formula della normalizzazione: quantità dello spot non normalizzato x PPM (scaling factor) / Fattore di normalizzazione

Vari tipi di analisi possono essere effettuate 28

Vari tipi di analisi possono essere effettuate 30

Gli spot possono essere elaborati anche con analisi statistica

… mettere in relazione i dati derivanti da set di analisi per es … mettere in relazione i dati derivanti da set di analisi per es. l’analisi quantitativa con l’analisi statistica 33

Ottenere alla fine un quadro riassuntivo degli spot di interesse

Gli spots vengono ricontrollati ed ottimizzati 35

Anche con l’aiuto dell’immagine 3D degli spot interessati

E’ possibile esaminare i gels relativi a diversi esperimenti … 37

… e confrontarne i risultati 38

Ogni proteina (spot) è caratterizzata da Mr - pI Ricerca nei Data Base 39

Se non è possibile ritrovare gli spot in data base allora si prosegue con l’analisi degli spot dal gel

SPOT CUTTER

ALCUNE DELLE APPLICAZIONI DELLA PROTEOMICA CAMPO FARMACEUTICO: STUDIO DEGLI EFFETTI DI NUOVI FARMACI E LORO TOSSICITA IDENTIFICANDO LE VARIE MODIFICAZIONI POLIPEPTIDICHE CAMPO AGRO-ALIMENTARE: STUDIO DI PROTEINE TOSSICHE O PROTETTIVE CHE SONO COINVOLTE IN MOLTI MECCANISMI DI RESISTENZA AD AGENTI PATOGENI E PARASSITARI SVILUPPATISI CON L’INTRODUZIONE DI TECNOLOGIE TRANSGENICHE NELLA CLINICA MEDICA: ANALISI DI MAPPE PROTEOMICHE COME MEZZO DI DIAGNOSI RICERCA DI NUOVI TARGET TUMORALI: DALLO STUDIO DI PROTEINE DI MEMBRANA E LORO CARATTERIZZAZIONE SI POTRANNO SVILUPPARE FARMACI SEMPRE PIU MIRATI ALLA LORO CURA

NELLA CLINICA MEDICA: ANALISI DI MAPPE PROTEOMICHE COME MEZZO DI DIAGNOSI SIA PER I TUMORI CHE PER LE MALATTIE INFETTIVE

RICERCA DI NUOVI TARGET TUMORALI: DALLO STUDIO DI PROTEINE DI MEMBRANA E LORO CARATTERIZZAZIONE SI POTRANNO SVILUPPARE FARMACI SEMPRE PIU MIRATI ALLA LORO CURA

Caratterizzazione della Proteina Tumorale TD52 4 5 6 7 S1 S3 S2 M (kDa) 25 _ 37 _ 50 _ 75 _ mappa 2D Caratterizzazione della Proteina Tumorale TD52 proteina anticorpo S1 S3 S2 4 5 6 7 25 _ 37 _ 50 _ 75 _

La 2-DE si può applicare anche con l’uso di isotopi radioattivi incubazione con S35 del campione solubilizzazione separazione in 2DE seccaggio del gel esposizione su lastra L’analisi comporta vari step Questo tipo di analisi può essere applicata allo studio di cinetiche cellulari