Tecniche avanzate per l’analisi quantitativa del proteoma Università degli Studi di Perugia Corso di Laurea Interfacoltà in Biotecnologie Fondamenti di Bioinformatica e di Biologia dei Sistemi Proteomica e Metabolomica Tecniche avanzate per l’analisi quantitativa del proteoma Pier Luigi Orvietani A.A. 2011-2012

Limitazione elettroforesi bidimensionale (2DE) Proteine altamente idrofobiche (Membrana) Riproducibilità del dato sperimentale Proteine ad alto peso molecolare Range dinamico Proteine basiche Spettrometria di massa Differential in gel electrophoresis (DIGE) ICAT iTRAQ Isotope-Coded Affinity Tagging Isotope Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation

Differential in gel electrophoresis (DIGE) Messa a punto nel 1997 (Unlü M, et al., Electrophoresis. 1997 Oct;18(11):2071-7. ) Supera alcune limitazioni della 2DE classica pH 4 pH 7 Aumento del range dinamico Aumento della sensibilità (femtomoli) Riduzione della variabilità tecnica (intracampione) Possibilità di individuare differenze di espressione di ±15%

Differential in gel electrophoresis (DIGE) La tecnica inizialmente prevedeva la marcatura delle proteine con due fluorofori differenti Cy3, Cy5 (legame covalente). I differenti campioni vengono mixati prima della 2DE e corrono contemporaneamente in un solo gel (< variabilità intergel). Le proteine presenti nei diversi campioni vengono rivelate tramite differenti scansioni a specifiche lunghezze d’onda (λ) con specifici apparati Tramite opportuni software le immagini vengono sovrapposte e dal differente grado di fluorescenza le proteine vengono quantificate.

Tipologie di fluorofori I fluorofori utilizzati nel DIGE per marcare i campioni sono gli stessi utilizzati nelle tecniche di analisi dell’espressione genica (microarray). Cy55 Cy3 Sono fluorofori solubili in acqua della famiglia delle cianine Cy3 ha una λ di eccitazione massima a 550 nm ed emette a 570 nm Cy5 ha una λ di eccitazione massima a 649 nm ed emette a 670 nm Possiedono un gruppo funzionale R che permette il legame alla molecola di interesse Il legame del fluoroforo avviene in ambiente basico (importante il TRIS 40mM) tramite la reazione del gruppo estere della N-idrossisuccinimmide con il gruppo amminico in epsilon dei residui di lisina delle proteine del campione (1-3% delle lisine) Non viene alterato visibilmente nella 2D né il pI né il peso molecolare

Marcatura minimale •Solamente il 3% delle proteine viene marcato (50 ug reagiscono con 400pM di dye) • La lisina è uno degli Aa più abbondanti in natura, marcando tutte le proteine presenti nel campione esse diverrebbero troppo idrofobiche • Eventuali marcature multiple non vengono visualizzate perchè sotto il limite di detezione (LOD) della tecnica •Nessuna distorsione nel pattern 2D

Marcatura a saturazione •È utilizzata nel caso di campioni con scarsa quantità di proteine • La reazione avviene tra il gruppo maleimidico del fluoroforo e il gruppo tiolico delle cisteine presenti nel campione (sono marcate tutte, elevato rapporto Dye/campione)

Elettroforesi Bidimensionale •Dopo la marcatura le proteine vengono normalmente separate mediante elettroforesi bidimensionale • La digitalizzazione dei gel invece si avvale di opportuni apparati

Standard interno Per aumentare la riproducibilità e la precisione della quantificazione è stato introdotto uno standard interno, composto da uguali quantità di proteine dei due campioni, ed è marcato diversamente. I vantaggi dello standard interno: Possibilità di identificare con sicurezza le variazioni di espressione delle proteine da eventuali errori sperimentali. Possibilità di “normalizzare” gli standard interni con conseguente riduzione del numero di ripetizione di corse.

< tempo di analisi software, > precisione Vantaggi DIGE 2DE classica DIGE 1° esp 2° esp 3° esp 1° esp Totale 9 gel 2° esp Totale 18 gel 3° esp < tempo di analisi software, > precisione

Analisi software Esistono numerosi software in grado di analizzare gel DIGE Decyder (GE Healthcare) PDQuest (Biorad) Progenesis Samespot (Nonlinear Dynamics) Delta 2D (Decodon software)

Applicazioni DIGE Studio fosforilazione e DIGE • Tramite DIGE è possibile studiare con precisione maggiore rispetto alla 2DE classica anche PTM di proteine • Studio su una forma mutante di tropomiosina (E54K) espressa da topi transgenici. • La proteina mutante possiede un differente pattern di fosforilazione visualizzabile con la comparsa nella mappa 2D di forme non fosforilate Warren et al. Proteomics 2008

Identificazione tramite Bottom-up Esistono due differenti approcci basati sull’utilizzo della spettrometria di massa per l’identificazione proteica, rispettivamente indicati con le locuzioni “top-down” e “bottom-up” La metodica “top-down” prevede l’utilizzo di una proteina intatta che viene frammentata direttamente all’interno dello spettrometro di massa L’approccio “bottom-up” prevede l’analisi dei peptidi derivanti dalla digestione delle proteine. I peptidi vengono utilizzati sia direttamente per rintracciare le molecole proteiche all’interno di specifici database (PMF), oppure di effettuare il riconoscimento attraverso il processo di frammentazione degli oligopeptidi in spettrometria tandem

Top-down Tale metodica prevede l’analisi della proteina intatta, la cui frammentazione avviene direttamente nello spettrometro di massa. In particolare, la frammentazione della molecola genitore crea una serie di ioni figli dalle cui masse si traggono le informazioni che consentono di risalire alla sequenza amminoacidica. La procedura “top-down” richiede una elevata accuratezza e, pertanto, rende necessario l’uso di particolari spettrometri di massa, quali lo spettrometro con analizzatore a risonanza ionica ciclotronica in trasformata di Fourier (FT-ICR), associato con un sistema di ionizzazione ESI. Gli strumenti FT-ICR sono in grado di intrappolare gli ioni utilizzando un campo magnetico statico, prodotto da un magnete superconduttore. In questo campo magnetico gli ioni sono “forzati” a mantenere un moto circolare con una caratteristica frequenza orbitale, dipendente dallo specifico rapporto m/z. Tale tipo di analizzatore, come la trappola ionica, consente di ottenere sia spettri di massa, che spettri di massa/massa, con una risoluzione molto elevata Vantaggi Questo approccio effettua analisi di MS/MS sull’intera proteina, ottenendo informazioni relative anche ad eventuali modificazioni post-traduzionali. Non si ha perdita di frammenti che può invece verificarsi quando l’analisi viene condotta sulla miscela di oligopeptidi ottenuti mediante digestione proteolitica della proteina in esame, così come nella procedura “bottom up”. Svantaggi Seppure questo tipo di approccio, per le sue caratteristiche, sia in forte crescita, esistono delle grandi limitazioni, in parte dovute all’alto costo, ma anche derivanti dalla non ancora soddisfacente disponibilità di algoritmi utili per ricavare tutte le informazioni necessarie.

Bottom-up L’approccio Bottom-up è quello che viene usato in proteomica quantitativa Metodologie basate su spettrometria di massa ICAT Isotope-Coded Affinity Tagging iTRAQ Isotope Tagging for relative and Absolute protein Quantitation SILAC Stable Isotope Labelling by Aminoacid in Cell colture

SELDI-TOF L’analisi SELDI-TOF-MS “Surface Enhanced Laser Desorption Ionizzation Time Of Flight Mass Spectrometry” tra le nuove tecniche di spettrometria di massa, sta acquistando un ruolo crescente negli studi clinici, soprattutto per la sua rapidità di analisi e la capacità di analizzare un grande numero di campioni in tempi relativamente brevi (“high-throughput”). Essa nasce dalla combinazione della tecnica MALDI-TOF-MS con la cromatografia di superficie ed offre il vantaggio di eseguire rapidamente l’analisi diretta del profilo proteico di campioni biologici in volumi molto piccoli.

SELDI-chip Superfici chimiche Superfici biologiche Nell’analisi SELDI-TOF-MS, i peptidi e le proteine presenti nel campione si legano in modo specifico ad un chip proteico in base alle proprie caratteristiche biochimiche, in quanto la superficie del chip è “funzionalizzata” con gruppi chimici opportuni. Superfici chimiche (Hydrophobic) (Anionic) (Metal Ion) (Cationic) Superfici biologiche (DNA - Protein) (Antibody - Antigen) (Receptor - Ligand) (PS10 or PS20) Carbonyldiimidazole

SELDI-TOF 2 1 4 3 SELDI: Surface Enhanced Laser Desorption Ionization Le proteine vengono ionizzate e rilevate tramite spettrometria di massa a tempo di volo 2 1 Il campione biologico viene applicato sui chip con capacità di ritenzione differente 4 Analisi statistica multivariata : PCA, clustering 3 Gli spettri di massa sono normalizzati e confrontati mediante procedure informatiche

SELDI-TOF caratteristiche Elevata resa analitica Utilizzo di piccole quantità di campione Basso potere di risoluzione Studio di campioni non frazionati Validazione bioinformatica non standardizzata Non si identificano le proteine Range di massa 1500-20000 Da

Applicazioni SELDI-TOF

BN-GEL Con la proteomica si cerca di riconoscere le proteine, ma anche segnarne la sua funzione e descrivere la sua relazione con altre proteine. Molte proteine sono organizzate spazialmente per formare complessi e ben distribuite ed assemblate nella membrana Il problema per l’analisi di queste proteine è la loro solubilizzazione e separazione senza perdere attività e caratteristiche Nel 1991 Schagger e Von Jagow hanno elaborato una tecnica per l’analisi di complessi proteici e di proteine a bassa solubilità ed inizialmente usata per studiare e separare i complessi mitocondriali senza dissociarli nei loro costituenti polipeptidici

BN-GEL Tale tecnica si basa sul fatto che viene aggiunto il Blue Coomassie al tampone di corsa (catodico) e questo si lega al complesso proteico conferendo una carica negativa che le fa migrare verso l’anodo ma contemporaneamente non lo denatura. Il Blue Coomassie si lega alla superficie del complesso avendo proprietà idofobiche, ma nello stesso tempo è sufficientemente solubile in solvente acquoso e la separazione che si ottiene non è dovuta al rapporto massa/carica, ma in base alla grandezza del complesso. Blue Native Il tampone di solubilizzazione è composto da: DETERGENTE- APOLARE n-dodecyl-β-D-maltopyranoside o la Digitonina Sale Zwitterionico acido amino-capronico con carica 0 a pH7

A metà corsa si cambia il tampone di corsa al catodo aggiungendolo senza Coomassie Dopo la 1°separazione si equilibrano le strisce in SDS in presenza di mercaptoetanolo