Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Unicam incontri Camerino 25-26 Settembre 2003 Altisonante Misterioso Inquietante

Nucleare

Prima portarono la CALAMITA.” “Tutti gli anni, verso il mese di marzo, una famiglia di zingari cenciosi piantava la tenda vicino al villaggio, e con grande frastuono di zufoli e tamburi faceva conoscere le nuove invenzioni. Prima portarono la CALAMITA.” Gabriel Garcia Marquez Cent’anni di solitudine Magnetica

Cronologia NMR 1945 Prima osservazione di un segnale NMR Bloch e coll. Stanford Un. (1H in H2O) Purcell e coll. Harvard Un. (1H in paraffina) (nobel 1952) 1950 Scoperta del Chemical Shift 1961 Primo spettrometro commerciale CW 1970 Primo spettrometro commerciale FT 1976 Primi esperimenti 2D ( Ernst 1991 Nobel) 1980 Spettrometri NMR di II generazione

L’origine fisica dell’NMR Pauli nel 1924 introdusse l’idea dello spin nucleare Protoni e neutroni possiedono un momento angolare di spin con relativo numero quantico di spin I=1/2 In nuclei diversi da 1H il numero quantico di spin può essere intero, semiintero o nullo; in particolare: numero di massa dispari spin semiintero numero di massa pari e n. atomico pari spin nullo numero di massa pari e n. atomico dispari spin intero L’NMR dipende dall’esistenza dello spin nucleare quindi nuclei con I=0 sono magneticamente inattivi.

Spin e abbondanza nucleare Isotopo Spin I % 1H 1/2 99.98 2H 1 0.016 12C 98.89 13C 1.11 14N 99.64 15N 0.36 16O 99.76 17O 5/2 0.037 31P 100

Momenti magnetici nucleari I nuclei hanno spin e sono carichi + ogni particella carica in moto produce un campo magnetico. ogni nucleo con un momento angolare possiede quindi un momento magnetico proporzionale. m = g P

<< Le cose hanno vita propria >> proclamava lo zingaro con aspro accento, << si tratta solo di risvegliargli l’anima.>> 2I+1 orientazioni possibili

g g1 E= g h IzHo DE= g h Ho

n=gHo DE=hn DE= g h Ho N-/N+=e-DE/kT Diagramma dell’energia Ho N- Livelli degeneri n=gHo

= g H0 Frequenza di precessione di Larmor Risonanza? H0

Irradiando il campione con delle opportune radiofrequenze e misurandone l’assorbimento potremmo ottenere lo “spettro” del composto in esame. 1H 13C 31P 15N MHz

Chemical shift Gli elettroni di un atomo inducono un piccolo campo magnetico che si oppone a quello principale Il campo magnetico sperimentato dal nucleo è generalmente minore del campo effettivo di un fattore s H = Ho (1- s) n = g H Nuclei dello stesso atomo assorbono a frequenze leggermente diverse a causa del loro “intorno chimico”

Diagramma di correlazione 1H NMR

“Molteplicità” dei segnali NMR Ad ogni protone (carbonio, azoto …) chimicamente diverso corrisponde un segnale di diversa frequenza. La “forma” del segnale in uno spettro NMR spesso non è un semplice picco di assorbimento ma può assumere aspetti molto diversi. Sigoletto Doppietto 1:1 Tripletto 1:2:1 Quartetto 1:3:3:1 Quintetto 1:4:6:4:1

n = g H0 La molteplicità dei segnali è dovuta ai “vicini di casa” Ho + d HaHb | | -C—C- b Ho a b Ho - d n = g H0 Doppietto 1:1

Ho + d HaHb | | -C—C-Hc b c a Ho 2 Ho Ho - d Tripletto 1:2:1

Tempi di rilassamento

Mxy Tempo Mz Mz=M0(1-e-t/T1)

Le Risonanze Magnetiche NMR in soluzione (ad alta risoluzione) NMR allo stato solido (CP-MAS) NMR in vivo Risonanza magnetica ( imaging)

NMR in soluzione NMR dei chimici I composti vanno sciolti in un solvente deuterato Massima omogeneità del campo magnetico Spettri affilati poiché il rapido moto casuale delle molecole media a zero le interazioni dipolari anisotropiche

magnete a super- conduzione computer controlli electronici magnete a super- conduzione

Solvente deuterato Tubo NMR

Tempo spin lock shim FT Sequenza d’impulsi Frequenza

FT

1H-NMR 2D NMR 13C-NMR

NMR allo stato solido (MAS) Nei solidi i nuclei sono costretti in una determinata posizione quindi le interazioni dipolari anisotropiche (dipendenti dall’orientazione) non si annullano e gli spettri sono molto larghi.

E.R. Andrew e I.J. Lowe dimostrarono che le interazioni dipolari anisotropiche si annullano se il campione è posto in rapida rotazione attorno ad un asse orientato a 54.74° rispetto al campo magnetico principale (Magic Angle Spinning MAS)

I campioni vengono polverizzati finemente, impaccati nel rotore e quindi messi in rotazione ad una velocità compresa tra 1 e 35 KHz Limitata utilità nei nuclei come 1H e 19F poiché gli accoppiamenti dipolari superano i 100 KHz.

MRS in vivo e MRI (imaging) Sono due tecniche molto conosciute per il loro utilizzo in campo biomedico ma in realtà possono essere usate in moltissimi campi scientifici. I principi fisici fondamentali sono gli stessi dell’NMR in soluzione o MAS ma le tecniche, la strumentazione e i dati ottenuti da questi esperimenti sono molto differenti. La prima differenza è la scomparsa del termine NUCLEARE dal nome delle tecniche. Le differenze fondamentali derivano dalle diversità dei “campioni” da analizzare: - omogenei nei primi due casi - assolutamente eterogenei nella MR

n = g H0 Ho La frequenza di risonanza diventa dipendente dallo spazio. Gradiente Ho n = g H0 Frequenza La frequenza di risonanza diventa dipendente dallo spazio.

Come si ottengono queste immagini? Vista della sezione orizzontale e verticale di un tubo NMR riempito di acqua e con una barretta di plastica al centro XY YZ Come si ottengono queste immagini?

Immagini per retroproiezione

MR imaging

MRS in vivo Tra le tecnologie emergenti della Medicina di laboratorio, la spettroscopia di risonanza magnetica in vivo (MRS) è particolarmente innovativa perché consente di esplorare direttamente sul paziente e in modo non invasivo la concentrazione intracellulare di alcuni intermedi metabolici e la funzionalità di diverse vie metaboliche. Invece di ottenere immagini dettagliate di tessuti con la MRS possiamo ottenere gli spettri di composti biochimici presenti all’interno di questi tessuti!

Con la spettroscopia RM del fosforo (31P-MRS): ATP fosfato inorganico (Pi) fosfocreatina (PCr) intermedi metabolici fosforilati (PME e PDE) concentrazione di Mg2+ pH intracellulare Si valuta la funzionalità di: fosforilazione ossidativa, glicogenonolisi, glicolisi …..

Con la spettroscopia RM del protone (1H-MRS): n-acetilaspartato (NAA) colina (Cho) creatina + fosfocreatina (Cr) glutammato e glutammina (Glx) mio-inositolo (m-I) e acido lattico (LA) Si valuta la funzionalità di: sistema glutamminergico ,metabolismo energetico, la osmoregolazione del SNC …….

In vivo 31P NMR di Corynebacterium glutamicum

.. José Arcadio Buendia … pensò che era possibile servirsi di quella invenzione inutile per sviscerare l’oro dalla terra. Lo zingaro, che era un uomo onesto, lo prevenne: << Per quello non serve >> 197Au