Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie per la Salute UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA Facoltà di medicina e chirurgia- Facoltà di veterinaria- Facoltà di farmacia Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie per la Salute ISOLAMENTO DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI DA SANGUE DEL CORDONE OMBELICALE Laureando: Arianna Beduschi Relatore: Prof. Roberto Sala Tutore: Dott. Stefano Negri

CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI Cellule staminali adulte multipotenti Fonti delle MSCs Capacità di aderire a superfici di plastica Capacità di differenziare: Adipociti; osteociti; cellule muscolari; Altro:neuroni, epatociti… Espressione di markers specifici POSITIVI: CD90; CD73; CD105; CD44; CD29; HLA-ABC NEGATIVI: CD34; CD45; CD14; HLA-DR

FONTI DI MSCs Agoaspirato midollare Tessuto adiposo Sangue e tessuti cordonali Placenta

IL SANGUE CORDONALE COME FONTE DI MSCs tessuto di scarto presenza di staminali mesenchimali ed emopoietiche MSCs da UCB hanno le stesse caratteristiche di quelle isolate da midollo uso autologo ed allogenico dibattito tra ricercatori sull’accessibilità alle MSCs: difficoltà d’isolamento meno MSCs rispetto midollo e Wharton’s jelly

Banca Autologa-Allogenica Mantovana del Cordone Ombelicale B.A.M.C.O.: Banca Autologa-Allogenica Mantovana del Cordone Ombelicale Obiettivo: tutelare sempre il diritto della madre a conservare il proprio sangue del cordone ombelicale per uso autologo e al tempo stesso garantire la possibilità di donare tale sangue per uso allogenico

Arrivo sacca sangue cordonale Calcolo del volume netto di sangue cordonale raccolto: Peso lordo sacca – peso sacca ( tara = 28 g) = peso netto sacca Peso netto sacca / peso specifico sangue (1.05 g/ml) = volume sacca con anticoagulante Volume sacca con anticoagulante – volume anticoagulante (20 ml) = volume netto sangue cordonale Aliquota per la ricerca: attenzione a NON pregiudicare mai la conservazione del sangue raccolto sia per uso autologo che allogenico!

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITÀ CON HISTOPAQUE-1007 Analisi multiparametrica al citofluorimetro: CD 34 – APC CD 45 – PERPC CD 90 – FITC CD 73 - PE Cellule MSCs-like Analisi multiparametrica al citofluorimetro: CD 34 – APC CD 45 – PERPC CD 90 – FITC CD 73 - PE Cellule MSCs-like Prelievo 0,5 ml per emocromo e analisi multiparametrica al citofluorimetro CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITÀ CON HISTOPAQUE-1007 Plasma Eritrociti Histopaque Sangue intero Histopaque Cellule mononucleate

SELEZIONE NEGATIVA DELLE CELLULE Cellule mononucleate SELEZIONE NEGATIVA DELLE CELLULE Utilizzo di biglie paramagnetiche rivestite di Ab CD34. Selezione negativa delle MSCs in quanto tali cellule non esprimono CD34.

IMDM + 10%FBS + bFGF 10ng/ml+ ITS+ 50 mg/ml COLTURE CELLULARI IMDM + 10%FBS + bFGF 10ng/ml+ ITS+ 50 mg/ml

I dati forniti dall’emocromo e dall’analisi multiparametrica al citofluorimetro sono stati utilizzati per calcolare la % di MSCs sulla frazione di cellule mononucleate nel sangue e dopo estrazione con Histopaque. La procedura di gating applicata è stata:

Cordoni di peso superiore a 90 g: Cordoni di peso inferiore a 90 g: RISULTATI sample % MSCs /cell mono nel sangue % MSCs/cell mono dopo estrazione Histopaque Cordoni di peso superiore a 90 g: Cord 10 0,058 0,074 Cord 11 0,078 0,040 Cord 12 0,119 0,014 Cord 13 0,152 0,132 Cord 15 0,010 0,140 media 0,083 ± 0,055 0,080 ± 0,055 Cordoni di peso inferiore a 90 g: Cord 18 0,382 Cord 19 0,029 0,306 Cord 20 0,092 0,177 0,066 ± 0,033 0,288 ± 0,104

Efficienza di estrazione : (42,19 ± 16,37) % RISULTATI Efficienza di estrazione : (42,19 ± 16,37) %

RISULTATI All’aumentare del volume di sangue cordonale raccolto aumenta la quantità di MSCs-like presenti. In proporzione la resa d’estrazione con Histopaque rimane la stessa.

RISULTATI La percentuale di MSCs-like diminuisce nel sangue intero con l’aumentare del tempo trascorso tra raccolta e lavorazione. I tempi migliori per l’estrazione con Histopaque sono tra 5 e 15 h.

RISULTATI Si ottengono colture dal 13% dei cordoni analizzati, percentuale che sale al 33,3 % se si considerano solo i cordoni di peso > 90g.

CONCLUSIONI L’analisi multiparametrica al citofluorimetro dimostra la presenza di cellule MSCs-like sia nel sangue cordonale che nella frazione di cellule mononucleate da esso ottenute. Con l’estrazione mediante centrifugazione in gradiente di densità non si perdono MSCs-like, anzi in alcuni casi aumenta la %. All’aumentare del volume di sangue raccolto aumenta la % di MSCs-like. Si ottengono colonie di MSCs-like solo da cordoni molto abbondanti, generalizzando con volume > 40 ml. I tempi migliori per la lavorazione del sangue cordonale sono tra 5 e 12 ore MA sono state ottenute colonie di MSCs-like da un cordone lavorato + di 24 h dopo la raccolta.? La coltura di MSCs-like è difficoltosa.

Cautela nel generalizzare i nostri risultati perché ottenuti su un ristretto numero di cordoni e su volumi ridotti in alcuni casi: Infatti sempre, in ogni caso, sono stati tutelati i diritti della madre e del neonato e la possibilità di donare il sangue cordonale per uso allogenico. Probabilmente se ci fosse la possibilità di lavorare tutto il sangue di una sacca idonea al congelamento la % di cordoni ombelicali da cui si ottengono colonie di cellule MSCs-like aumenterebbe.