TRASMISSIONE GABAERGICA Il GABA (acido g-amino butirrico) è il neurotrasmettitore a carattere inibitorio più abbondante nel cervello dei mammiferi (~ 35-40 % delle sinapsi sono GABAergiche) Alterazioni della trasmissione GABAergica sono alla base di malattie mentali e neurologiche quali i DISTURBI D’ANSIA e l’EPILESSIA Sintesi del GABA: L-glutammato ---------------> GABA GAD (PF) GAD = glutammato decarbossilasi PF = piridossal-fosfato (cofattore) La distribuzione della GAD nel SNC riflette quella del GABA: livelli elevati nelle terminazioni nervose (nel citoplasma) < conc. nei neuroni del SNP anche in tessuti non nervosi (es: pancreas, rene, ovaio) (I)  predomina nel tessuto nervoso Inibita da antagonisti del PF (es: isoniazide, I-MAO) dall’acido amino-ossiacetico e dal Cl- GAD (II)  in tessuti non nervosi (rene, vasi, cell. gliali) Stimolata dall’acido amino-ossiacetico, non è inibita dal Cl- Dopo essere stato sintetizzato nel citoplasma, il GABA viene traslocato nelle vescicole sinaptiche ad opera del VGAT

DEGRADAZIONE METABOLICA DEL GABA A seguito di stimolazione, il GABA viene rilasciato mediante esocitosi dalle vescicole e liberato nello spazio sinaptico. Gli effetti del GABA sui recettori pre- o post-sinaptici cessano in seguito al trasporto (Na+/Cl--dipendente) del neurotrasmettitore in cellule neuronali o gliali. DEGRADAZIONE METABOLICA DEL GABA L-Glu GABA GABA-T (deaminazione) a-chetoglutarato + NH2 SEMIALDEIDE SUCCINICA SAS-deidrogenasi (NAD) ACIDO SUCCINICO GABA-Transaminasi: Si trova legata ai mitocondri E’ l’enzima chiave nella regolazione dei livelli cerebrali di GABA => ⊝ GABA-T => ↑↑ GABA (effetto antiepilettico*) Inibitori: Acido amino-ossiacetico (> potenza rispetto a GAD), g-vinil-GABA*, Etanolamina-O-solfato*, Acido valproico*

Ricaptazione del GABA: Neuroni (⊝ dall’acido carbossilico cis-1,3- aminocicliesano, ACHC) GAT (Na+/Cl--dip) Cell. gliali (⊝ dalla b-Ala) Farmaci inibitori del GAT (acido 2,4-diaminobutirrico (DABA), b-alanina e acido nipecotico) hanno effetti antiepilettici. La tiagabina (analogo dell’ac. nipecotico, inibitore selettivo del GAT1 neuronale) è in fase avanzata di sperimentazione clinica per la terapia dell’epilessia parziale refrattaria ad altri trattamenti.

Distribuzione del GABA (GAD) nel SNC: SNPR -> collicolo superiore via nigro-collicolare via nigro-talamica SUBSTANTIA NIGRA SNPR -> nuclei talamici via nigro-tegmentale Tegmento ponto-mesencefalico via striato-nigrale GLOBO PALLIDO/STRIATO SNPR IPOTALAMO CORPI QUADRIGEMINI CORTECCIA CEREBRALE IPPOCAMPO -> Interneuroni GABAergici fanno sinapsi con le cellule piramidali ippocampali CERVELLETTO -> >> conc. nelle cellule di Purkinje Minori concentrazioni di GABA in: Ponte, bulbo e sostanza bianca CELLULE GLIALI -> uptake + catabolismo del GABA

RECETTORI DEL GABA GABAA  recettore-canale permeabile al Cl- AG: muscimolo, isoguvacina AT: bicucullina (competitivo), picrotossina (non comp.) Modulatori: BDZ e barbiturici GABAB  recettore accoppiato a proteine G AG: baclofen, CGP44532 AT: faclofen, CGP35348, CGP36742 Modulatori: Ca2+ (↑ affinità del GABA x il rec. GB1) CGP7930 (interagisce con GB2) GABAC  recettore-canale permeabile al Cl- Insensibile al baclofen e alla bicucullina GABAA e GABAC: mediano una risposta inibitoria RAPIDA a livello post-sinaptico GABAB: mediano una risposta inibitoria neuronale più LENTA e duratura (localizzazione sia pre- che post-sinaptica)

I RECETTORI GABAA Sono recettori-canale permeabili agli ioni Cl- (Vm -> VeqCl- ~ -70mV) => Iperpolarizzazione di membrana => ↓ eccitabilità cellulare In alcuni distretti (es. midollo spinale): VeqCl- meno elettronegativo (carenza di sistemi di estrusione?)  GABAA-R  fuoriuscita di Cl- dalla cellula => depolarizzazione che può generare un potenziale d’azione x attivazione dei canali per il Na+ voltaggio-dipendenti Indicazioni terapeutiche degli agonisti del recettore GABAA: ANSIA (es. BDZ) EPILESSIA DISORDINI DEL SONNO ASTINENZA DA ETANOLO INDUZIONE E MANTENIMENTO DELL’ANESTESIA Esistono diversi sottotipi recettoriali formati da differenti combinazioni delle subunità, la cui espressione varia a seconda del tipo cellulare e della regione cerebrale e che mostrano diverse proprietà farmacologiche => farmaci più selettivi!!!

STRUTTURA MOLECOLARE DEL RECETTORE GABAA ETEROPENTAMERO Le cinque subunità si dispongono in maniera pseudo-simmetrica intorno al canale per il Cl-. Le diverse subunità hanno una similitudine del 30-70% e un’alta omologia con le subunità dei recettori nAChR, GlyR e 5-HT3 I principali sottotipi presenti nel cervello e in organi periferici sono formati dalle subunità a e b assemblate con una o più subunità g, d e e. Forma più diffusa nel SNC: a1b2g2 (~60% di tutti i rec GABAA) Ogni subunità recettoriale presenta (~nAChR e GluR): • 4 TM • Ansa di 13 aa compresi fra due Cys al N-term S 13 aa

Sito di legame per il GABA: • Domini extracellulari della subunità b • Partecipano anche a, g e d • Vi si legano anche GABA-mimetici (muscimolo) e antagonisti comp (bicucullina) Sito di legame per le BDZ: • Definito anche “recettore centrale per le BDZ” • Subunità a (ma è necessaria anche la presenza di g2) • Vi si legano anche: le b-carboline (AG-inversi  ↓ interazione del GABA con il proprio sito di legame) il FLUMAZENIL (AT competitivo  privo di attività intrinseca, blocca l’azione sia di AG che di AG inversi che interagiscono con il sito di legame delle BDZ) Sito di legame per i BARBITURICI: • Si trova all’interno del poro (regione TM2 della subunità b) • Vi si legano anche la picrotossina (AT diretto) e il TBPS (t-butil biciclo fosforotionato: AT allosterico) AZIONI dei BARBITURICI: - A basse conc: modulatori allosterici  ↑ influsso di Cl- in presenza di GABA - A conc + alte: agiscono direttamente sul canale aprendolo (indipendentemente dalla presenza di GABA) - A conc molto alte: bloccano la corrente del Cl-

MECCANISMO DI APERTURA DEL CANALE: GABA+R  piccola rotazione del dominio extracellulare delle subunità recettoriali x formazione di ponti disolfuro. Tali modificazioni covalenti mantengono il canale aperto. BARB  ↑ durata media di apertura del canale BDZ  ↑ frequenza di apertura (e chiusura) del canale Zn2+  ↓ on-rate e ↑ off-rate SINERGISMO FARMACOLOGICO FRA BDZ E BARBITURICI: L’attivazione del sito di legame x le BDZ favorisce sia l’interazione del GABA che quella dei barbiturici con i rispettivi siti di legame Il legame dei barbiturici all’interno del canale favorisce il legame sia del GABA che delle BDZ con il recettore

Siti di legame per l’ETANOLO e gli ANESTETICI VOLATILI: • Siti di legame specifici a livello del canale anionico • Adiacenti ai siti di legame per i neurosteroidi EtOH  TM2 e TM3 della subunità a Anestetici  TM1, TM2 e TM3 della subunità a + - + Alto e basso potenziamento dell’effetto di AG Alta e bassa inibizione dell’effetto di AG Nessun effetto - studi in vitro

a1: a2: g2: g1 e g3: a5: tolleranza Ruolo delle diverse subunita’ negli effetti mediati dal recettore GABAA a1: ► IPNOSI da BDZ (altre subunità per barbiturici e neurosteroidi) ► DEPRESSIONE DELL’ATTIVITA’ MOTORIA DA BDZ (ratti con mutazioni su a1 sono resistenti alla depressione motoria indotta da diazepam) ► AMNESIA ANTEROGRADA (contribuisce anche a3) ► EFFETTI ANTIEPILETTICI (mediati solo parzialmente da a1: contribuisce anche a2) a2: ► EFFETTO ANSIOLITICO1 ► EFFETTO MIORILASSANTE2 (contribuisce anche a3) Rappresentano solo il 15% di tutti i recettori GABAA Abbondano nella corteccia1 e nell’ippocampo + strati superficiali delle corna dorsali del midollo spinale e nei motoneuroni2 Es: zolpidem > affinità per i recettori contenenti a1 => potente ipnotico, debole ansiolitico Diazepam  > affinità per i recettori contenenti a2, a3 e a5 => potente ansiolitico a5: tolleranza g2: importante per la localizzazione post-sinaptica del recettore GABAA (durante la sinaptogenesi) Interagisce con la GEFIRINA (proteina citoscheletrica importante per la localizzazione post-sinaptica del recettore) g1 e g3: formano (assieme alle subunità a e b) complessi recettoriali con scarsa affinità per le BDZ

FOSFORILAZIONE DEL RECETTORE GABAA I principali siti di fosforilazione si trovano nel loop intracellulare fra TM3 e TM4 (~ nAChR) a => PK non identificata b => PKA e PKC g2 => Tyr-K Fosforilazione cAMP-dipendente: - è uno dei più importanti meccanismi di regolazione del GABAA -  velocità di desensitizzazione del recettore in neuroni corticali e ippocampali, ma non in quelli spinali PKC: causa ↓ ampiezza delle correnti al Cl- indotte dal GABA

RECETTORI GABAB ETERODIMERO: GABAB1 + GABAB2 (si legano a livello del dominio C-terminale intracellulare) GABAB1 e GABAB2  7TM C-terminale intracellulare Lungo dominio N-terminale extracellulare Il GABA si lega alla porzione extracellulare della subunità GABAB1 => modifica conformazionale del recettore => accoppiamento della subunità GABAB2 alle proteine G Funzioni GABAB2: accoppiamento con effettori corretta localizzazione di GABAB1 (nella membrana) Distribuzione del recettore GABAB: Talamo Corteccia Strato molecolare del cervelletto Corna dorsali del midollo spinale Ippocampo (cellule piramidali e giro dentato) SN e VTA (<) Cellule gliali Gangli, utero, testicolo, cell muscolari lisce, fegato, etc. Representative autoradiogram of a sagittal section of rat brain labelled with [3H]CGP62349 (4nM)

Nel cervello esistono 2 isoforme: GABAB(1a) e GABAB(1b)

↓processi di fosforilazione Sistemi effettori accoppiati ai recettori GABAB 1) La stimolazione dei recettori GABAB si traduce principalmente nell’attivazione di proteine G0 e Gi => ΘAC => ↓ cAMP Θ PKA ↓ trascrizione di geni controllati da CRE (cAMP-responsive elements) [es: TH, somatostatina, pro-Enk, etc.] ↓processi di fosforilazione 2) Θ VOCCs (di tipo P/Q ed N) presinaptici => ↓ liberazione neurotrasm Tale effetto sembra dipendere da un’azione diretta delle proteine G0 e Gi sul canale al Ca2+ e non dipende dai livelli di cAMP 3)  canali al K+ postsinaptici => iperpolarizzazione neuronale Si generano IPSPs che sono + lenti in “onset” e + duraturi rispetto agli IPSPs rapidi derivanti dall’attivazione dei recettori GABAA e GABAC. L’attivazione dei canali al K+ avviene a seguito dell’interazione del complesso Gbg con il dominio C-terminale dei canali al K+.

FARMACOLOGIA DEI RECETTORI GABAB AGONISTI: (-)Baclofen (Lioresal ®): b-p-clorofenil-GABA Muscolo-rilassante usato nel trattamento degli spasmi muscolari da danno spinale e nella sclerosi multipla Altri effetti degli AGs: Θ arco riflesso del singhiozzo antitussivo ↓ drug addiction (x Θ sist mesolimbico) Antinocicettivo (Θ rilascio sost P e glu dalle fibre afferenti nelle corna dorsali del midollo spinale) Ansiolitico ANTAGONISTI: Faclofen: passa poco la BEE CGP35348: attraversa la BEE CGP36742: AT di 2a generazione => + potente e selettivo Potenziali impieghi terapeutici: Epilessia delle assenze ↑Performances cognitive in animali da laboratorio (CGP36742  clinical trials x disturbi cognitivi e malattia di Alzheimer “moderati”) Depressione MODULATORI ALLOSTERICI POSITIVI: CGP7930 GS39783: Rispetto al Baclofen non dà sedazione, non altera i processi cognitivi e non induce ipotermia

RECETTORI GABAC Espressi prevalentemente nei neuroni della retina, ma presenti anche in diverse regioni del SNC Complessi omomerici o eteromerici di subunità r1 (retina), r2 (retina e SNC) e r3. Le subunità r mostrano un’omologia del 30-38% con le subunità del recettore GABAA Ruolo nel controllo inibitorio delle risposte indotte dalla luce (?) AT selettivo: TPMPA (Acido(1,2,5,6-tetraidropiridin-4-il)metilfosfinico) AG: b-Ala, Tau, Gly