Laboratorio di biologia cellulare Colture cellulari

Linea cellulare NIH3T3 Cellule di fibroblasti embrionali di topo

Foto 1° giorno (4 Aprile) della piastra di partenza dalla quale sono state ottenute le varie subcolture Nucleo con addensamenti di cromatina Probabile cellula in divisione Vacuoli Si può notare che la piastra è molto confluente (oltre il 90%)

Foto 3° giorno (8 Aprile) di una delle 4 piastre di subcoltura allestite il 6 Aprile Si può notare che la piastra è ancora molto confluente (oltre il 90%)

Foto della piastra linea Foto 4° giorno (11 Aprile) Foto di una delle 2 piastre contate per allestire il 2° punto della curva Foto della piastra linea Si notano le cellule allungate che sono quelle adese alla superficie Piastra molto confluente (90%)

Foto della piastra linea foto 5° giorno 13 Aprile Foto di una delle 2 piastre contate per allestire il 3° punto della curva Foto della piastra linea La confluenza è diminuita rispetto alla piastra del giorno precedente Piastra confluente all’80% (piastra linea); si notano bene i nuclei con gli addensamenti di cromatina

vitalità la vitalità è risultata dell’89%; come valore va bene, tenendo conto che dopo il congelamento è normale una certa percentuale di mortalità delle cellule.

CURVA DI CRESCITA Fase di senescenza Fase di crescita esponenziale giorni 08-apr 11-apr 13-apr 15-apr 18-apr 20-apr N° cellule/mL 25.000 630.000 822.000 888.000 675.000  576.000 log N° cellule 4,4 5,8 5,91 5,95 5,83 5,76 

La curva di crescita riflette l’andamento standard di una coltura cellulare con la differenza che manca la fase di latenza perché siamo partiti da 25.000 cellule (tempo 0). La fase di “senescenza” (solitamente visibile dopo diverse settimane) può essere dovuta all’esaurimento di alcuni componenti del terreno di coltura (ad es. glutammina) e alla parziale acidificazione del mezzo stesso (visibile colorazione tendente al giallo); da considerare anche che le cellule non adese e quelle morte a seguito dei lavaggi vengono eliminate.

08-apr 11-apr 13-apr 15-apr 18-apr 20-apr 55 26 18 31 23 25 51 28 13 22 16 47 36 29 33 46 43 15 37 20 17   52 11 45 14 12 49 24 9 21 27 10 21,2 27,4 31,75 22,5 18,44444 MEDIA 5,163978 7,728734 14,08861 11,48602 5,237229 11,33701 DEVIAZIONE STD

Riportiamo di seguito il grafico della curva di crescita con l’aggiunta della deviazione standard

Fluorescenza Sintox green Falloidina Colora il nucleo Colora l’actina Le formazioni rotondeggianti verdi sono i nuclei, l’alone che si nota intorno ad esse è il citoplasma Si nota l’actina citoscheletrica colorata in rosso

Foto di una delle 2 piastre contate per allestire l’ultimo punto della curva (20 Aprile). Ci sono segni di evidente sofferenza delle cellule (molti vacuoli), probabile contaminazione da micoplasmi. Corpi apoptotici

In conclusione, come opinione soggettiva del gruppo, possiamo dire che questo laboratorio è stato di grande interesse perchè ci ha permesso di avere una visione generale su quello che accade in un laboratorio di colture cellulari e di avere un’esperienza pratica che non è mai stata fatta in passato.