Funzione di organi e apparati Esame e analisi di: Liquidi biologici metaboliti, cofattori, vitamine, basi azotate, nucleotidi, amino acidi proteici e non proteici; proteine, peptidi acidi nucleici; zuccheri, lipidi ormoni, neurotrasmettitori; metalli, ioni inorganici. sangue urine saliva liquor cefalorachidiano liquido amniotico

Esami del sangue: Oltre alle analisi chimico-cliniche, il sangue è una matrice biologica elettiva per effettuare un numero molto elevato di accertamenti: Dopo centrifugazione Plasma o siero: Analisi del sistema di coagulazione Esami immunologici (ex. ricerca anticorpi) Autoimmunità (produzione di autoanticorpi) Esami endocrinologici Esami tossicologici, monitoraggio farmacologico Esami microbiologici (ex. ricerca di fattori batterici e proteine virali) Parte cellulare: linfomonociti, granulociti e piastrine per indagini immuno-ematologiche mirate (immunità cellulo-mediata, infiammazione, coagulazione). Esami virologici mirati (ex. in linfociti). oppure in Sangue intero: VES, emocromo, analisi morfologica delle cellule (striscio). Esami microbiologici (ex. emocolture).

IL PRELIEVO DI SANGUE E IL CAMPIONAMENTO PER LE ANALISI CHIMICO CLINICHE Il prelievo è parte integrante dell’esame. Deve essere condotto in modo da non alterare i risultati finali e può essere eseguito secondo modalità diverse in base al tipo di esame in corso. Sicurezza e igiene: uso di materiale sterile e monouso; vacutainer che riducono i rischi connessi alla manipolazione del sangue e l’emolisi. L’indagine di laboratorio deve essere eseguita a breve termine dal prelievo; se questo non è possibile, il campione viene solitamente mantenuto in frigo (+4°C) fino al momento del dosaggio, da portare a termine nel minor tempo possibile. Si può eventualmente congelare plasma o siero. Tipo di prelievo: sangue venoso periferico, capillare, arterioso (per emogas analisi). Sangue venoso periferico: quantità variabile, in genere 5-10 ml. A digiuno: la mattina dopo 8-12 ore dall’ultimo pasto. Non nell’urgenza. EMOLISI: da evitare per non creare interferenze causate dagli enzimi eritrocitari che possono modificare il metabolita ricercato oppure l’analisi di enzimi indicatori di patologia (ex. CPK, LDH).

Analisi chimiche centrifugazione Siero: parte liquida che si ottiene per centrifugazione del coagulo. Si fa coagulare il sangue a t.a. o a 37°C. Non contiene fibrinogeno. Plasma: si ottiene per centrifugazione del sangue intero in presenza di anticoagulante ANTICOAGULANTI Sodio o litio eparina: mucopolisaccaride, anticoagulante biologico, presente nell’organismo. Interferisce poco sulle determinazioni chimiche. EDTA: acido etilendiammino acetico sale dipotassio (più solubile del disodio). 2 g/dl. Chelante degli ioni Ca++(cationi divalenti). Puo’ dare interferenze in certi esami. Citrato di sodio tribasico (3.8 g/dl) o ossalato di sodio (1.34 g/dl)

Analisi chimiche del sangue Misura quantitativa di parametri biochimici e chimici che sono indicatori di stati patologici acuti e cronici a carico dei principali organi vitali: cuore, fegato, reni, cervello, milza, pancreas, polmoni, midollo osseo. In circolo si riversano metaboliti (substrati, prodotti) di sintesi o catabolismo provenienti da tutti i distretti anatomici. Inoltre: indicatori di citolisi: enzimi che operano nei vari organi, contenuti nelle cellule parenchimali, che aumentano nel sangue per danno a carico delle cellule – enzimi di sortita. Stato metabolico. Ormoni, endocrinologia e neuroendocrinologia. Possiamo quindi distinguere le analisi chimiche del sangue in esami di screening e indagini più specifiche ed approfondite. Range di valori fisiologici: valori di riferimento ottenuti dall’analisi, in larga scala, di soggetti in buono stato di salute. Profili di screening: test di controllo su soggetti sani che possono essere ripetuti nel tempo ad intervalli regolari: non si giunge ad una diagnosi ma all’eventuale indirizzo verso ulteriori esami più mirati; oppure screening selettivi in soggetti a rischio o in stato d’urgenza. In tal caso gli esami aiutano la diagnosi del medico curante. Indagini preliminari correlate alla funzione di uno o più organi. Esempio del fegato: Attività protidosintetica Metabolismo dei glucidi Metabolismo dei lipidi Funzione biligenetica e biliescretrice Funzione detossificante

Profili di screening: funzionalità d’organo Profilo epatico: Proteine totali, albumina, metaboliti epatici, bilirubina totale e diretta, glucidi, lipidi e lipoproteine; enzimi di sortita relativi all’epatocita: GOT (ASAT), GPT (ALAT), LDH (isoforma 5, anche 4) fosfatasi alcalina e g-GT (gamma-glutamiltranspeptidasi). Profilo renale: Proteine totali, albumina, acido urico, BUN, creatinina, indicatori di mancata funzione depuratrice del nefrone. Profilo cardiaco: infarto miocardico: GOT, LDH1, e CPK enzimi principali- oltre a Troponina (3-6 ore), indicatore precoce d’infarto del miocardio. Si analizza anche la GPT. Lipoproteine, colesterolo, trigliceridi, glucosio. Profilo d’urgenza: profilo GPT, GOT, CPK, bilirubina, glucosio, creatinina.

Profilo epatico Proteine totali e albumina: attività protidosintetica del fegato. Ridotte proteine nel plasma – ridotta funzione epatica – cirrosi, epatite Bilirubina diretta coniugata con glucoronato nel fegato – funzioni biliari, ittero, funzione epatica. Lipoproteine e lipidi, colesterolo e trigliceridi. Lipidi endogeni sintetizzati dal fegato che li sintetizza e li manda in circolo o nella bile. Lipoproteine a diversa densità (HDL/LDL). Dieta scorretta può dare steatosi. Enzimi di sortita: GPT, glutammico piruvico transaminasi (alanina aminotransferasi) - valori 10-40 U/Lt (uomo) ; 5-35 U/Lt (donna)- elevata in cirrosi, epatiti, ittero epatico. GOT, glutammico ossalacetico transaminasi (aspartato transferasi)- 40-45 U/Lt- più elevata negli uomini; l’aumento è indice di cirrosi, epatite, ma anche di altre patologie d’organo, in particolare nell’infarto. g-GT, gammaglutamil-transpeptidasi (enzima non solo del fegato: anche nel pancreas, reni, intestino, milza) – epatiti, cirrosi epatica, epatite tossica, ittero, alcolismo. Fosfatasi alcalina (enzima del fegato ma anche di altri organi, intestino, tubuli renali, vie biliari): epatiti tossiche, colestasi, ittero ostruttivo. LDH4,5: isoforme epatiche e del muscolo scheletrico Glucosio: conversione di altri zuccheri in glucosio, fosforilazione, conversione reversibile in glicogeno, glicolisi.

Automazione e miniaturizzazione uso di strisce reattive Analisi chimiche del sangue con reazioni colorimetriche miniaturizzate e automatizzate. Riduzione significativa del volume del prelievo di sangue, riduzione dei tempi di analisi e contenimento degli errori per robotizzazione della procedura. Strumento opportunamente tarato con siero di controllo. Laboratorio di chimica clinica in miniatura. Dotazione di minicentrifuga e miniprovette con e senza anticoagulante. Applicazioni: strumento che può venire impiegato nel territorio, nel pronto soccorso, grazie alle dimensioni ridotte: uso da trasporto. Altri usi: quando vi è necessità di screening in larga scala e rapidità di risultati: nel volontariato, assistenza in luoghi di catastrofe naturale, ex: terremoto; nelle missioni in Africa e Asia; progetto di applicazione nelle prigioni, in scuole, nel privato. Impiego nei piccoli presidi sanitari locali, difficilmente raggiungibili dalle unità mobili di soccorso: ex. isole, luoghi di alta montagna. Impiego anche ad uso turistico, in crociere di medio e lungo corso. Uso di strisce reattive, mono o multiparametriche (5 o 6 parametri). Lo strumento può analizzare molte strisce in simultaneo. Pochi microlitri di siero o plasma vengono impiegati. Quindi il prelievo di sangue può essere di soli 2-3 ml, riducendo l’invasività dell’esame. Possono essere misurati molti parametri nel giro di 5-7 minuti. Sticks Spotchem: Strip base Tre strati: Strato di trattenimento campione Strato dei reagenti Strato di supporto Reagent field

Test e reazioni utilizzate nelle strisce reattive Test colorimetrici Le strisce monoparametro hanno un codice a barre che associa la lettura colorimetrica alla determinazione di un parametro chimico preciso: questo consente il riconoscimento del test da parte dello strumento che seleziona la l operativa (nm), effettua la misura sul campione e fornisce il quantitativo del parametro in base ad una retta di calibrazione interna. Strisce reattive Codice a barre per l’identificazione del test

Esempio di reazioni utilizzate dal sistema: Le strisce multiparametro hanno anche un codice di identificazione della serie di analisi (5/6) che la striscia contiene: ex. profilo renale: proteine totali, albumina, azotemia, creatinina, acido urico. Il test include un “data-sheet” con tutte le informazioni su reazioni e reagenti impiegati per la determinazione di ogni parametro, sulle interferenze, le condizioni di prelievo e campionamento - rischio di falsi positivi e negativi. Ex: striscia per il glucosio: viene indicato l’uso del test della glucosio ossidasi e l’interferenza negativa dell’ ac. ascorbico. Viene anche indicata la presenza dell’enzima ascorbato ossidasi tra i reagenti per eliminare questa interferenza. Esempio di reazioni utilizzate dal sistema: surfactant Trigliceridi: lipoproteina trigliceride + H2O CPK- creatina fosfochinasi: trigliceride libero + proteina lipoprot.lipasi glicerolo + ac. grasso glicerolo kinasi glicerolo-3-fosfato + ADP glicerolo+ ATP glicerolo-3-fosfato ossidasi diidrossiacetone fosfato + H2O2 glicerolo-3-fosfato + O2 perossidasi H2O2 + 4-amino-antipirina + cromogeno (anilina) Colore blue (610 nm). CPK Creatina fosfato + ADP Creatina + ATP esochinasi ATP + glucosio glucosio-6P + ADP G6PDH Glucosio-6P + NADP Ac. 6 fosfogluconico + NADPH diaforasi NADPH + blu tetrazolio NADP + colore porpora (550 nm)