Dosaggio ELISA di lipoproteine HDL

Classi di Immunoglobuline: IgM, IgG, IgA, IgD e IgE Antigene: componente strutturale di batteri, virus,funghi; ex. proteine e polisaccaridi della parete cellulare di batteri. Antigene Ogni Ig riconosce un singolo epitopo: clone di linfocita B e risposta monoclonale; un antigene origina una risposta policlonale: cloni di linf B diretti verso i vari epitopi della molecola Antigeni self e non-self. Fisiologia: risposta anticorpale verso antigeni non self (batteri, virus, funghi, elminti, etc..). Patologia: risposta anticorpale anche verso antigeni self epitopi Anticorpi (Ig)

ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Dosaggio quantitativo di sostanze sfruttando la reazione antigene-anticorpo (Ag-Ab) e la formazione di immunocomplessi. E’ un test affidabile e sensibile,utilizzato in molti dosaggi analitici di routine. Versatilità diagnostica: microbiologia, autoimmunità, monitoraggio farmacologico, etc... Combina la specificità degli anticorpi con la sensibilità dei dosaggi enzimatici Principio: Sfrutta la capacità delle superfici di plastica a legare stabilmente le proteine. E’ un saggio in fase solida effettuato su piastre da microdosaggio a 96 pozzetti: queste permettono di testare contemporaneamente un elevato numero di campioni e volumi molto piccoli. Si sfrutta la specificità della reazione Ag-Ab e la formazione dell’immunocomplesso “fissato” al fondo del pozzetto che viene riconosciuta per la marcatura di una delle due componenti (Ag o Ab) con un enzima (E) il cui prodotto di reazione è colorato e misurabile spettrofotometricamente. Tecnologia molto diversificata - schematicamente: ELISA diretto, indiretto, test sandwich Diretto  1) Ag del campione viene fatto legare alla piastra e questo viene misurato aggiungendo un Ab specifico primario direttamente legato a E che fa avvenire la reazione colorimetrica ; 2) viene fatto aderire previamente alla piastra l’ Ab specifico per l’ Ag realizzando poi una competizione con una quantità nota di Ag marcata con E (test competitivo). Indiretto  Viene aggiunto rispetto al test diretto un passaggio con un altro Ab detto secondario, specifico o per l’Ag o per l’Ab primario. L’Ab secondario è legato a E per la rivelazione. Sandwich  E’ un sottotipo di dosaggio ELISA : Ab legato alla piastra si legherà all‘Ag a cui si legherà Ab secondario marcato con l’enzima che lega un altro epitopo dell’Ag. Ne esistono numerose varianti , dirette o indirette. Limite: provvede informazioni solo sulla presenza/concentrazione di una molecola, non dando informazioni sulle sue proprietà biochimiche (es peso molecolare, localizzazione cellulare, ecc

Principio della metodica ELISA indiretto - antigene legato alla piastra ELISA indiretto – anticorpo legato alla pistra Lettura a 405 nm P-NPP Fosfatasi alcalina L’antigene viene purificato e legato alla piastra. Si aggiunge il siero/plasma da analizzare. Se presenti, le immunoglobuline specifiche per l’antigene formano il complesso antigene-anticorpo. Le molecole che non si sono legate vengono eliminate tramite lavaggi. Si aggiunge un secondo anticorpo marcato, che abbia specificità per le immunoglobuline della specie da cui il siero/plasma testati derivano. Il secondo anticorpo si lega al complesso antigene-anticorpo immobilizzato sulla piastra. La quantificazione avviene misurando la quantità di anticorpo secondario legato, grazie all’utilizzo di substrati colorimetrici.

ELISA: enzimi e substrati Caratteristiche dei substrati: • composto stabile • sicuro, non tossico • poco costoso Il metodo più utilizzato per la rivelazione dell’avvenuto legame antigene-anticorpo consiste nella coniugazione dell’anticorpo secondario con una molecola che può essere direttamente rivelata. Anticorpi coniugati ad enzimi: vengono utilizzati enzimi in grado di convertire un substrato incolore in un prodotto colorato. • Fosfatasi Alcalina: per anticorpi coniugati alla fosfatasi alcalina si usa in genere il substrato p-nitrofenilfosfato (pNPP), che sviluppa un intenso colore giallo misurabile a 405-410 nm. • Perossidasi: per gli anticorpi coniugati alla perossidasi vi sono vari substrati che danno prodotti diversi. La misura è sempre colorimetrica.

ELISA: diluizioni seriali L’obiettivo del test ELISA utilizzato è quello di stimare la concentrazione di HDL. Questo è possibile ottenendo una retta standard dalla quale ottenere la concentrazione incognita nel campione di siero dei soggetti in analisi. Il test viene eseguito diluendo progressivamente sia la preparazione standard (concentrazione nota) sia il siero (concentrazione sconosciuta nei soggetti). Lo standard viene solitamente diluito serialmente: es 2-fold: 2-4-8-16-32-64-128-……. Si ottiene una curva standard utilizzata per determinare la concentrazione dell’HDL nei soggetti in analisi. I sieri dei campioni da analizzare vengono diluiti una sola volta, dopo aver opportunamente valutato la diluizione. Esempio di diluizione seriale 1/10 Controllo positivo Controllo negativo Calibratori : determinazione della concentrazione dell’analita

ELISA: quantificazione dei risultati Il colore sviluppato dalla reazione dell’enzima coniugato all’anticorpo secondario è proporzionale alla concentrazione di analita presente nel campione di siero analizzato e rimasto legato alla piastra mediante l’ antigene. La quantificazione può essere ottenuta dalla curva standard. Se il campione rivela un valore di assorbanza > controllo negativo e/o compreso tra i valori del siero calibratore si determina la quantificazione in base alla retta di taratura.

Colesterolo E’ uno sterolo, cioè una molecola costituita da quattro anelli policicloalifatici (condensati tra loro in formazione trans) e una coda alifatica, oltre ad eventuali gruppi funzionali, come l'ossidrile, che fa sì che il composto sia un alcol cicloalifatico. Funzioni Il colesterolo fa parte della membrana cellulare di tutte le cellule animali: si inserisce fra gli due strati di fosfolipidi orientandosi con il gruppo -OH vicino alle teste polari dei fosfolipidi, diminuendo così la fluidità del mosaico ma aumentando la stabilità meccanica e la flessibilità delle cellule. Assieme con molecole proteiche il colesterolo regola lo scambio di sostanze messaggere tramite la membrana cellulare. Il colesterolo è la sostanza base per la sintesi degli ormoni steroidei (aldosterone, cortisone, testosterone, estradiolo) Il colesterolo prodotto nel fegato viene impiegato in buona parte per la produzione di bile (emulsiona i lipidi alimentari per renderli assorbibili dall'intestino tenue)

Trasporto del colesterolo Il colesterolo insieme ai trigliceridi vengono trasportati nel plasma sotto forma di lipoproteine caratterizzate da un nucleo contenente lipidi non polari (esteri del colesterolo e triglicerdi) circondato da un rivestimento polare di fosfolipidi, colesterolo libero e apoproteine Secondo la loro composizione in colesterolo, fosfolipidi, proteine, trigliceridi e acidi grassi, questi aggregati vengono ulteriormente distinti in diverse classi: VLDL, IDL, LDL, HDL2 e HDL3. I chilomicroni sono i principali trasportatori di triacilgliceroli, mentre le LDL sono i principali trasportatori di colesterolo. I chilomicroni, secreti dall’intestino, trasportano tutti i lipidi e le molecole lipofile assorbite dalla dieta ai vari distretti dell’organismo. I chilomicroni residui sono poi assorbiti dal fegato, che rilascia le VLDL, particelle che trasportano lipidi endogeni prodotti dagli epatociti e lipidi esogeni. Dopo aver rilasciato i triacilgliceroli ai tessuti periferici, le VLDL diventano LDL. Le LDL sono i principali trasportatori plasmatici di colesterolo ai tessuti extraepatici. Le HDL, secrete dal fegato, svolgono invece un ruolo inverso: legano il colesterolo rilasciato nel plasma dal turnover cellulare e lo riportano al fegato dove avviene il catabolismo.