Struttura della Parete vegetale

Struttura della Parete vegetale Lamella mediana: pectina Parete Primaria: emicellulose Parte Secondaria: cellulosa e lignina

LE ARMI DEL PATOGENO STRUTTURE MORFOLOGICHE SPECIALIZZATE (Appressori e Austori) Con queste armi il patogeno, in un ospite non resistente o suscettibile, è in grado di aggredire con maggiore o minore successo una pianta. ENZIMI DEGRADATORI TOSSINE

Modalità di decomposizione IFA OH Lip MnPOX e LAC e OH e OH LAC MnPOX Gluc Glc Glc Glc Glc Glc Glc Glc Glc

Austori

Degradazione Cellulosa La cellulosa è il polimero naturale più abbondante Catene lineari di glucosio Tre tipi di enzimi fungini che la degradano: le CELLULASI

Cellulasi endo--1,4-glucanasi: agisce all’interno della catena polisaccaridica, frammentandola in unità più piccole ed esponendo le terminazioni all’azione dell’enzima CBH cellobioidrolasi (CBH): agisce aggredendo il polimero alle estremità, scindendo successivamente il disaccaride cellobiosio -glucosidasi (o cellobiasi): scinde il cellobiosio in due unità di glucosio.

Degradazione Pectina E’ il principale costituente della lamella mediana Catene lineari di un altro zucchero: l’acido galatturonico Gli enzimi degradanti prendono il nome di PECTINASI

Pectinasi pectinametilesterasi: deesterifica la pectina a pectato e metanolo pectina liasi: attacca direttamente la pectina, tagliando i legami glicosidici interni pectato liasi: svolge la stessa azione della pectina liasi ma attacca i pectati esopoligalatturonato liasi: attacca le estremità del polimero (polipectato), rilasciando solo digalatturonati poligalatturonasi: la reazione di taglio del poligalatturonato avviene per idrolisi dei legami glicosidici all’interno del polimero e produce oligomeri

Degradazione Lignina Contiene 3 tipi di composti fenolici uniti tra loro a formare una fitta trama Gli enzimi Ligninolitici sono di due tipi: Rottura anello fenolico Rottura della trama

Ligninasi Lignina - perossidasi (conosciuta anche come ligninasi), contenente ferro Fe(III), catalizza la perossidazione delle unità non aromatiche della lignina Manganese - perossidasi, che agisce similmente alla lignino - perossidasi, ma ossida il manganese Mn(II)Mn(III), come elemento mediatore nel trasferimento degli elettroni laccasi (una fenolo - ossidasi), che ossida direttamente la molecola di lignina (in generale ossida i composti fenolici a fenossi - radicali)

Le tossine Fattori prodotti da microganismi patogeni che inducono l’alterazione di processi metabolici causando il disturbo di quei processi fisiologici che mantengono la pianta e portano allo sviluppo della malattia Come fanno? Alterano la permeabilità della membrana cellulare Inattivano o inibiscono alcuni enzimi Inducono una carenza di elementi nutritivi fondamentali per la pianta

Non-host selective toxins Host-selective toxins Inducono da sole tutti o parte dei sintomi della malattia non solo sulla pianta-ospite ma anche in altre piante che in natura non sono attaccate da quel patogeno Inibizione enzimatica (tabtoxin e phaseolotoxin) Alterazione membrana cellulare Inibizione della trascrizione negli organelli (tagetitoxin) Perossidazione delle membrane lipidiche (cercosporin) Host-selective toxins Sostanze prodotte da un microrganismo patogeno che a concentrazioni fisiologiche sono tossiche soltanto per l’ospite Victorin T-toxin HC-toxin AM-toxin

Tabtoxin HN OH O CH2 H2N-CH-CO—NH-CH-CO2H Pseudomonas syringae pv tabaci Wildfire disease of tobacco Macchie necrotiche sulle foglie Inattiva la glutamina sintetasi- accumulo di ione ammonio che porta ad un disaccoppiamento della fotosintesi dalla fotorespirazione e distrugge i tilacoidi, portando a clorosi e a necrosi H2N-CH-CO—NH-CH-CO2H CH2 OH O HN tabtoxinine threonine

Tentoxin Alternaria alternata Tetrapeptide ciclico Inattiva il chloroplast-coupling factor coinvolto nel trasferimento di energia nei cloroplasti Inibisce la fosforilazione foto-dipendente dell’ADP in ATP Inibisce l’attività delle polifenolossidasi

Malseccina Phoma tracheiphila Mal secco degli agrumi Altera la fotosintesi interagendo (?) con il complesso della glicina decarbossilasi (ciclo fotorespiratorio dell’azoto) L’alterazione di questo ciclo porterebbe a un ridotto riciclo di NH4+ e a tutte le conseguenze fisiologiche legate a un suo depauperamento E’ noto infatti che carenze di azoto portano a clorosi….uno dei sintomi indotti da Pt60!

Victorin Cochliobolus victoriae Pentapeptide ciclico Riproduce tutti i sintomi esterni della malattia indotta dal patogeno Alterazione della parete cellulare Perdita di elettroliti dalla cellula Aumento della respirazione Decremento di crescita e sintesi delle proteine

AT-toxin Alternaria alternata apple pathotype (A. mali) cyclic peptide È estremamente selettiva per varietà di mele suscettibili Porta a perdita di elettroliti e di clorofilla

Alterazioni ormonali Auxine (A. tumefaciens, P. savastanoi) Alti livelli di IAA rendono la pectina, la cellulosa e i componenti proteici della parete più accessibili Inibiscono la lignificazione dei tessuti Aumentano la traspirazione Gibberelline (Gibberella fujikuroi) Piante di riso infettate da questo fungo crescono più rapidamente e più “alte” delle piante sane

Alterazioni ormonali Citochinine (Rhodococcus fascians) Alti livelli di CK La magiore attività delle citochinine sembra essere correlata con il fenomeno delle “green island” zone di riattivazione del ciclo cellulare confinanti a zone di senescenza Etilene (P. solanacearum) Nel frutto di banana infettato con questo patogeno il contenuto di etilene aumenta proporzionalmente alla prematura maturazione dei frutti

Chi è Phoma tracheiphila? L’agente causale del “Mal secco” degli agrumi Ascomicete mitosporico Classe: Coelomycetes Ordine: Sphaeropsidales Famiglia: Sphaeropsidaceae Genere: Phoma

Phoma tracheiphila Non è stato trovato il ciclo gamico, mentre presenta 3 forme di riproduzione agamica I picnidi (P) si formano negli elementi corticali più esterni dei rami giovani I macroconidi (C) vengono differenziati nei tessuti infetti I tallo-conidi che si ritrovano nella linfa e vengono usati come forma rapida di diffusione

Mal secco degli agrumi P. tracheiphila colpisce tutte le specie di Citrus coltivate, manifestandosi particolarmente aggressivo sul limone La produzione italiana di questo agrume ha subito un calo del 50% dalla comparsa di questo agente infettivo (1918)

Sistema Phoma tracheiphila x Citrus Gli alberi affetti dal Mal secco presentano la sindrome tipica delle tracheomicosi Il decorso della malattia può essere rapido o lento a seconda del sito di attacco del patogeno (chioma – radici) e delle condizioni ambientali (Topt14-28°C; UR >65%) Si ha la morte più o meno rapida di parti più o meno estese della pianta

Ciclo di infezione di Phoma tracheiphila Il micelio di Phoma arriva attraverso il terreno alla pianta e attacca lo xilema producendo negli elementi vascolari legnosi un micelio molto abbondante attraverso la via della traspirazione arriva poi alle foglie e ai germogli causando clorosi, seguite da filloptosi, appassimento …… e successiva morte!

Le Tossine P. tracheiphila produce tossine nei tessuti della pianta infettata, in particolare nello xilema e da questo poi traslocate nei tessuti parenchimatici delle foglie e delle gemme dove inducono i sintomi della malattia Sono stati isolati diversi composti extracellullari dal filtrato colturale di Phoma e alcuni di questi mostrano tossicità quando reinoculati puri sulla pianta

Il complesso della Malseccina E’ stato isolato un composto fitotossico non selettivo chiamato MALSECCINA che induce nella pianta gli stessi sintomi della malattia. Da questo composto sono state isolate due glicoproteine di 93 e 60 kDa, Quest’ultima, designata Pt60, induce da sola clorosi e necrosi sulle foglie di limone

Pt60 - Isolamento Coomassie stained SDS-PAGE. Fogliano et al., 1998 La tossina viene rilasciata nel filtrato colturale quando incubata in condizioni di luce continua a una T di 23°C La proteina è stata isolata e mediante HPLC accoppiata a un pulsed-liquid protein sequencer sono state deteminate le sequenze N-terminali di 6 peptidi, per un totale di 77 AA Coomassie stained SDS-PAGE. Fogliano et al., 1998

Pt60 - Struttura Glicotrack detection. Fogliano et al., 1998 Pt60 è una glicoproteina: 55% componente glicosidica 45% componente proteica Se privata della sua parte glicosidica è facilmente inattivata dalle proteasi della pianta Studio in banca dati dei 6 peptidi sequenziati Glicotrack detection. Fogliano et al., 1998

BLAST P analysis Peptidi BLAST P result % Id QSYGDLFSEPGFFLPDPVEPLD Polyphenol oxidase-nitroreductase 75 EAVESGFYK connectin 78 AESSLLR Fe-S oxidoreductase 100 NYFAQLXVEVGPY UDP-N-acetylglucosamine 3-O-acyltransferase 57 GNQII Nitrite reductase 85 DVIVVGGGSGGTY Glutathione reductase –Electron transfer oxidoreductase 83

Pt60-probabile Funzione -1 La tossina iniettata pura nelle foglie riproduce l’effetto clorotico e necrotico Tali effetti si producono solo se la foglia è illuminata Induce danni alle membrane cellulari (induce elecrolyte leakage)

Pt60-probabile Funzione -2 Altera la fotosintesi interagendo (?) con il complesso della glicina decarbossilasi (ciclo fotorespiratorio dell’azoto) L’alterazione di questo ciclo porterebbe a un ridotto riciclo di NH4+ e a tutte le conseguenze fisiologiche legate a un suo depauperamento E’ noto infatti che carenze di azoto portano a clorosi….uno dei sintomi indotti da Pt60!

Pt60-probabile Funzione -3 In base ai risultati dell’analisi BLASTP si potrebbe ipotizzare che esista in Pt60 almeno un dominio di deidrogenazione o di legame con FAD/NAD L’azione di Pt60 si potrebbe espletare attraverso il sequestro di potere riducente, necessario al completamento del ciclo della glicina decarbossilasi

Risultato dell’analisi TBLASTX 2.2 PEPTIDI TBLASTX ID.-POS.(%) SCORE QSYGDLFSEPGFFLPDVE Fe transporter Benzoate 4-hydroxylase 32-54 33-76 84.3 75.3 EAVESGFYK NADH reductase 54-70 84.7 AESSLLR ABC transporter 42-53 92.7 NYFAQLXVEVGPY NADH dehydrogenase 67-74 157 GNQII Potenzial zinc finger protein 37-70 42.0 DVIVVGGGSGGTY Monoamine oxidase 50-65 89.9

RT-PCR   Fe transporter ABC transporter Benzoate-4-hydroxylase monoamine oxidase Benzoato 4 idrolasi attiva contro composti antimicrobici eventualmenti presenti nel liofilizzato di monachello (tolleranza?) ABC transporter e trasportatore del Fe strettamente legati con la patogenicità (attivaz enzimi litici) Monoammina ossidasi che può causare accumulo di ROS e di ammonio (necrosi) effetti simili a malseccina

I vari filtrati sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e confrontati con Pt60 a b c d e f g   97KDa 66 KDa 45 KDa 30 KDa CONT MON FEM Pt60 CONT MON FEM 21g 21g 21g 30g 30g 30g

Carbon-nitrogen hydrolase Analisi Maldi-Tof Mw pI Protein Id Localization Peptide Match Mass Matched Coverage-Score 23.8 9.0 b-glucosidase extracellular 3 17 66-40 25.4 4.92 probable outer membrane protein cytoplasmic 6 8 43-40 29.8 8.94 Dehydrogenases mytochondrial 11 38-49 30.8 7.71 Monoamine oxidase 2-4 (3-6) 13 67-54 31.7 6.60 Carbon-nitrogen hydrolase 5 41-32 36.8 6.52 DppB protein transport system for maltose Plasma membrane 1-4-6 39-49 23.4 5.00 Fe transporter 4 52-31 Pt60 C21 F21 C30 F30

Analisi Maldi-Tof/Tof Protein Id Localization N-site peptides Score Monoamine oxidase extracellular N-Glyc cAMP PKC CK2 N-myr Prenyl Microb-tgt 1)VLMALRPR 2) VNKSGIPPLPERRASESRKDVEAR 3) NSPRFRFWGTTPFLWHR 4) DCGEWSSAAELTR 5 )DIAPFIDIRNPEEEITK 60 75 78 81 89 ABC transporter Plasma membrane (plant) TK N-Myr ATP/GTP BS PK-ATP BS RLSGKAGSNTNFD YYKKPGNATVEPA SSHGGSAAKGAATTKFRTIHGVPGA KGNHVKDVINDAEKFNIAGR 67 56 cont fem

Prove fisiologiche su filtrato Il filtrato del fungo (PT2338) cresciuto in presenza del liofilizzato della varietà sensibile (femminello) presenta una stimolazione delle attività litiche (PG e LAC), mentre in presenza della varietà tollerante (monachello) delle attività antiossidanti (SOD,+++ e CAT,+) g g g g g g

Prove fisiologiche su micelio Il micelio di Phoma tracheiphila (Pt2338) cresciuto in presenza del liofilizzato della varietà tollerante (monachello) presenta, infatti, una stimolazione delle attività antiossidanti (SOD e GSH POX) g g g g g g

Prove di tossicità su foglie di limone 4g 6g I filtrati del fungo sono stati poi concentrati e purificati e quindi iniettati in foglie di limone. Contemporaneamente è stata saggiata la malseccina purificata

Prove fisiologiche in limone Il filtrato del fungo da varietà tollerante (monachello) attiva: 13-lipossigenasi,enzima coinvolto nella formazione di acido jasmonico glutatione perossidasi, enzima antiossidante coinvolto nello scavenging dei lipoperossidi e dell’H2O2

Conclusioni L’analisi molecolare di Pt60 sembra indicare la presenza di un complesso proteico, la cui funzione sembra essere legata sia ad un induzione di stress ossidativo (monoammina ossidasi) nelle cellule vegetali che ad attività enzimatiche litiche e di trasporto connesse con la patogenesi Varietà sensibile (Femminello): - composti extracellulari-elicitori induzione di enzimi litici (PG e ligninasi) Varietà tollerante (Monachello): - riconosce il fungo e induce stress ossidativo extracellularmente il fungo produce meno tossina e non causa effetto necrotico.