High Performance Liquid Chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography

Principi e applicazioni L’HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) è la versione strumentale della cromatografia liquida su colonna La fase mobile è un liquido a bassa viscosità e la fase stazionaria è costituita da particelle porose eventualmente rivestite da una fase liquida

Principi e applicazioni La fase stazionaria è impaccata in una colonna di lunghezza variabile tra 3 e 50 cm e di diametro interno (ID) di pochi mm. Poiché le particelle del riempimento hanno una granulometria molto piccola (da 3 a 10 mm) il flusso dell’eluente può essere ottenuto solo esercitando una pressione relativamente elevata mediante apposite pompe

Principi e applicazioni Con una colonna di 25 cm, ID 4 mm e fase stazionaria di 5mm, per ottenere un flusso di n-esano di 1mL/min è necessaria una pressione in ingresso di 70 atm Ma esistono colonne di 3 cm con ID>1mm e con granulometria di 3 mm.

Tecniche HPLC Possono essere suddivise In base alla polarità delle fasi In funzione del meccanismo della separazione In base alle caratteristiche della fase stazionaria

Tecniche HPLC In base alla polarità delle fasi Cromatografia a fasi normali (NPC) Fase stazionaria polare e fase mobile apolare Cromatografia a fasi inverse (RPC) Fase stazionaria apolare e fase mobile polare

Tecniche HPLC In funzione del meccanismo della separazione Cromatografia di adsorbimento (LSC) Cromatografia di ripartizione (LLC) Cromatografia di esclusione (SEC) Cromatografia di scambio ionico (IEC) Cromatografia di affinità (AFC) Cromatografia di coppia ionica (IPC)

Tecniche HPLC In base alle caratteristiche della fase stazionaria Cromatografia su fase legata (BPC) Cromatografia su fase chirale (CPC)

Grandezze, parametri e prestazioni Tempo e volume di ritenzione Dipende dal tempo di ritenzione (tR) a dal volume di ritenzione (VR) che vengono corretti in base al tempo e al volume morti (tM, VM) VR = tRFc dove Fc è il flusso di fase mobile in mL/min V’R = VR – VM e t’R = tR – tM Poiché si usano pompe molto precise è quindi il flusso può essere mantenuto rigorosamente costante nelle analisi ci si può riferire al solo tempo di ritenzione disinteressandosi del volume.

Grandezze, parametri e prestazioni Coeff. di distribuzione (Kc), fattore di ritenzione (k) e rapporto di fase (b). Sono collegati tra loro dalle seguenti relazioni:

Grandezze, parametri e prestazioni Coeff. di distribuzione (Kc), fattore di ritenzione (k) e rapporto di fase (b). Per arricchire la fase mobile dei componenti eluiti si può operare sulla polarità di entrambe le fasi modificando il Coeff. di distribuzione Kc, oppure sulla quantità di fase stazionaria (Vs) modificando così il fattore di ritenzione k

Grandezze, parametri e prestazioni Selettività La selettività di un sistema cromatografico è la capacità di eluire sostanze diverse in tempi diversi. In base ai parametri già visti il fattore di separazione a viene così definito:

Grandezze, parametri e prestazioni Selettività Dipende dalla temperatura e dalla natura delle due fasi. Si possono preparare fasi mobili di varie polarità e si può, inoltre, far variare la polarità nel corso dell’analisi. Questa procedura si definisce “analisi in gradiente di polarità”

Grandezze, parametri e prestazioni Efficienza È la capacità di un sistema cromatografico di eluire una sostanza in una banda stretta Tra i fattori determinanti per l’efficienza di un sistema HPLC, quello più importante è legato ai fenomeni che si verificano all’interno della colonna.

Grandezze, parametri e prestazioni Efficienza Il modello della teoria dei piatti introduce le grandezze di riferimento più usate a questo proposito: il numero di piatti teorici N e l’altezza equivalente al piatto teorico H che sono correlate tra loro tramite la seguente relazione: dove L è la lunghezza della colonna. Una colonna è tanto più efficiente quanto più elevato è il numero di piati teorici. A parità di lunghezza ciò che conta è che sia piccolo il valore di H ( in genere è compreso tra 0,01 e 0,02 mm).

Grandezze, parametri e prestazioni Efficienza Per aumentare l’efficienza si può intervenire in due modi: 1.        aumentare la lunghezza 2.        abbassare il valore di H agendo su parametri operativi Per abbassare H si può intervenire su: 1.       La velocità lineare della fase mobile che deve essere sufficientemente alta 2.       Il diametro delle particelle della fase stazionaria che deve essere piccolo 3.       Lo spessore del liquido o dello strato attivo che deve essere sottile 4.       La viscosità della fase mobile che deve essere bassa 5.       La temperatura che deve essere relativamente alta

Risoluzione La risoluzione (Rs) fra due picchi adiacenti è espressa dal rapporto fra la loro distanza (tR2 – tR1) e la semisomma delle rispettive larghezza alla base (wb1 + wb2)/2 Un aumento di temperatura fa aumentare l’efficienza ma fa diminuire la selettività per cui la risoluzione peggiora. Per questo la maggior parte delle determinazioni si fa avvenire a temperatura ambiente ottimizzando la risoluzione mediante variazioni di composizione dell’eluente o con determinazioni in gradiente di polarità.

Capacità La capacità di carico di una colonna varia secondo che sia di tipo analitico o preparativo. Nel primo caso si possono iniettare da poche decine a centinaia di nanogrammi di sostanza, nel secondo si arriva fino a 500 mg.

MATERIALI Caratteristiche generali delle fasi Fase stazionaria La fase stazionaria è costituita da materiale granulare che può interagire con la fase mobile o fare da supporto alla fase stazionaria liquida vera e propria (che può essere depositata sul supporto o legata ad esso chimicamente) I riempimenti sono di due tipi: a) particelle pellicolari e b) microparticelle porose a) sono costituite da un nucleo sferico non poroso (vetro) rivestito da un sottile strato di materiale microporoso b) possono essere di forma irregolare o sferiche con diverso grado di porosità e diametri compresi tra 3 e 10 mm e oltre. Le microparticelle consentono una migliore efficienza e una capacità più elevata, ma tendono a rigonfiarsi e sono più difficili da impaccare.

MATERIALI Caratteristiche generali delle fasi

MATERIALI Caratteristiche generali delle fasi

Caratteristiche generali delle fasi A)     fase mobile I requisiti generali sono:  ·  bassa viscosità ·  bassa volatilità ·  immiscibilità con la fase stazionaria ·  minima tossicità ·  capacità di solubilizzare il campione ·  basso costo e facile reperibilità ·  compatibilità con il rivelatore ·  elevata purezza ·  bassa corrosività      

Cromatografia Liquido-Solido (LSC) La cromatografia liquido solido utilizza fasi stazionarie granulari a varia porosità, generalmente polari, che vengono accoppiate a fasi mobili non polari (cromatografia a fasi normali). È poco usata

Cromatografia Liquido-Solido (LSC) Fase stazionaria Si usano: Gel di silice, gel di silice pellicolare o allumina

Cromatografia Liquido-Solido (LSC) Fase mobile Si definisce Forza eluotropa la forza del solvente rispetto alla fase stazionaria

Cromatografia Liquido-Solido (LSC) Criteri per la scelta della coppia fase mobile/fase stazionaria Si può procedere ad una separazione preliminare in TLC per valutare la scelta. In genere si usa gel di silice come fase stazionaria e un solvente apolare mescolato con piccole percentuali di un solvente polare.

Cromatografia su Fase legata (BPC) Nella cromatografia su fase legata la fase stazionaria è legata chimicamente al supporto solido con cui forma un tutt’uno particolarmente stabile.

Cromatografia su Fase legata (BPC) Fase stazionaria: microparticelle di gel di silice, di zircone, di materiali contenenti legami C-F, polimeriche. La fase legata può essere di tipo polare e quindi con fase mobile non polare o di tipo non polare con fase mobile polare.

Cromatografia su Fase legata (BPC) Fase stazionaria:

Cromatografia su Fase legata (BPC) Fase mobile Nella fase di messa a punto di un metodo di separazione si inizia variando la conc. del solvente polare partendo dall’1% e aumentando via via i modo opportuno. Nella C a fase inversa si usa una miscela di acqua con un solvente idromiscibile meno polare

Cromatografia di esclusione (SEC) Si tratta di una cromatografia su una fase stazionaria formata da un gel che non permette la permeazione alle molecole che superano una determinata dimensione (che quindi vengono eluite per prime). La fase stazionaria è costituita quindi da Gel che possono essere rigidi o semirigidi. Il solvente deve avere i seguenti requisiti: deve sciogliere completamente il campione, non deve interagire con esso e neppure con il gel, non deve causare fenomeni di ripartizione e deve essere compatibile con il rivelatore.

Cromatografia di esclusione (SEC)

Cromatografia di scambio ionico (HPIEC) Si usa per analizzare le specie elettricamente cariche. Per separare queste specie si devono usare fasi stazionarie in grado di scambiare ioni con l’eleuente cioè degli scambiatori ionici. Non sono però esclusi meccanismi diversi come la ripartizione e l’adsorbimento. Due sono le applicazioni principali: 1) separazione di molecole organiche elettricamente cariche 2) separazioni di ioni inorganici.

Cromatografia di scambio ionico (HPIEC) Fase stazionaria: scambiatori cationici forti (analisi di cationi metallici) scambiatori cationici deboli (proteine e polipeptidi) scambiatori anionici forti (proteine) scambiatori anionici deboli.

Cromatografia di scambio ionico (HPIEC) I supporti sono di vario tipo: particelle di silice porosa particelle di silice porosa legate a un copolimero particelle pellicolari di resina scambiatrice particelle porose polimeriche altri tipi

Cromatografia di scambio ionico (HPIEC) Fase mobile Si devono prendere in considerazione le variabili: pH, forza ionica e l’eventuale modificatore organico Si tratta quasi sempre di soluzioni tampone

Cromatografia di scambio ionico (HPIEC)

STRUMENTAZIONE

IL CROMATOGRAFO PER HPLC Il cromatografo per HPLC può assumere varie configurazioni secondo che sia destinato a funzionare in condizioni isocratiche oppure in gradiente di eluizione. In quest’ultimo caso la miscelazione può avvenire prima (bassa pressione) oppure dopo (alta pressione) dell’ingresso nella pompa

IL CROMATOGRAFO PER HPLC

Riserva della fase mobile Sono contenitori di materiale inerte, per non inquinare il solvente, con una capacità tale da assicurare l’esecuzione di un certo numero di analisi. I materiali usati sono in genere: vetro, acciaio inox o PTFE. La capacità in genere non supera mai i 2 L per la chimica analitica (con flussi medi di 1-2 mL/min e durata dell’analisi di pochi minuti), mentre possono essere necessari volumi maggiori per la preparativa. Il solvente passa al Cromatografo attraverso un piccolo tubicino che contiene in genere un filtro in vetro sinterizzato per trattenere eventuali impurità grossolane.

Pompe - requisiti Fornire elevate pressioni in ingresso (fino a 400 atm, cioè circa 5800 psi); Mantenere il flusso di eluente il più costante e riproducibile possibile; Consentire un’ampia gamma di flussi ( da 0,5 a 10 mL/min); Avere un volume morto molto piccolo (minima variazione di composizione dell’eluente in determinazioni in gradiente); Avere un adeguato sistema di smorzamento delle pulsazioni; Avere una notevole inerzia chimica; Avere una elevata autonomia; Consentire rapide operazioni di ricambio della fase mobile e di pulizia; Essere poco rumorosa, poco ingombrante, priva di vibrazioni eccessive e sicura quando si manipolano solventi infiammabili.

Pompe - schema Oramai si usano solo pompe a doppio effetto (reciprocanti a due pistoni)

Filtri Per impedire che granelli di materiale di qualunque tipo entrino in colonna si usa un sistema di filtri (diametro pori di 5-10µm) a monte dell’iniettore

Sistemi per realizzare il gradiente di concentrazione

Sistemi di iniezione Il campione può essere inserito mediante una microsiringa (sistema oramai abbandonato) o mediante una apposita valvola azionata manualmente o meccanicamente.

Sistemi di iniezione

Colonne Le colonne sono in acciaio o in vetro borosilicato con pareti molto spesse. Si usano di preferenza colonne corte che eventualmente possono essere collegate in serie. Per proteggere la colonna vera e propria talvolta si usano delle precolonne con la stessa fase stazionaria ma di granulometria più grande.

Termostato Per assicurare la riproducibilità dell’analisi, la variazione di temperatura deve essere molto inferiore all’1%. La termostatazione della colonna avviene o per circolazione forzata dell’aria o per immersione in un bagno termostatico (in questo caso la colonna è incamiciata.

Raccoglitori di frazioni Nelle separazioni preparative si utilizzano sistemi automatici altrimenti si sostituisce il contenitore di raccolta manualmente utilizzando un corto tubicino flessibile di uscita.

Misuratori di flusso Si usano: Sistemi a bolle Sistemi volumetrici Flussometro Sistema gravimetrico

Rivelatori Non esistono rivelatori universali (unico tentativo il Tridet della PE). Le loro caratteristiche si giudicano in base ai seguenti parametri: Selettività Risposta o segnale Stabilità (deriva) Limite di rivelabilità Rumore di fondo Linearità Sensibilità Volume morto (volume del rilevatore stesso) che deve essere il più piccolo possibile

Rivelatori Vengono alloggiati un una apposita cella detta cella di flusso

Spettrofotometri UV-Vis Si distinguono: rivelatori a lunghezza d’onda fissa (i più diffusi) rivelatori a lunghezza d’onda variabile rivelatori a serie di diodi (diode array)

Spettrofotometri UV-Vis

Sistema di elaborazione dei segnali Di solito un PC o un registratore si su carta che a display

METODI DI ANALISI Analisi qualitativa Analisi quantitativa