Informazioni utili E-mail: usare anche saverio.minucci@ieo.eu In cc: cristina.signoroni@ieo.eu ed alessandra.marinelli@ieo.eu Campus IFOM-IEO, Via Adamello 16 Libri: Abbas-Lichtman: le basi dell’immunologia Pier-Lickzak-Wetzler: immunologia-infezione-immunità Test finale: 2 domande aperte Una a piacere Una scelta da me Lezioni su sito L'home page: http://users.unimi.it/minucci/index.htm le lezioni si troveranno cliccando su didattica : http://users.unimi.it/minucci/didattica.htm Anche su Ariel (di solito ci vuole più tempo)

Concetti di base di Immunologia

Immunità Resistenza dell’individuo alle malattie, in particolare a quelle infettive Due meccanismi principali di immunità: Adattativa: emerge durante la vita dell’individuo ed in seguito all’esposizione ad un agente infettivo, è specifica per quell’agente infettivo e conferisce protezione immunitaria a successive esposizioni allo stesso agente Innata: è immediata, non è specifica e non conferisce protezione immunitaria

Antigeni Ogni sostanza che può stimolare qualsiasi tipo di risposta immunitaria adattativa (p.es. produzione di anticorpi) viene definita un antigene

Sistema immune Insieme di cellule e molecole che effettua la risposta immunitaria (innata o adattativa) Ha 4 compiti principali Riconoscimento immunologico: cioè deve fare da “sensore” e capire che una infezione è in corso Cellule bianche del sangue (granulociti e macrofagi) per la risposta immune innata Linfociti per la risposta immuni adattativa Eliminazione dell’agente che espone l’antigene Anticorpi, molecole del complemento, funzioni dei linfociti citotossici e delle cellule della risposta innata Auto-regolazione: deve evitare che la risposta sia eccessiva Quando fallisce si hanno le malattie autoimmuni Proteggere l’individuo da successive esposizioni allo stesso antigene Tipica della immunità adattativa

Le cellule del sistema immune hanno origine nel midollo osseo Sistema immune è costituito da leucociti, che originano nel midollo osseo Tutte le cellule del sangue (incluso I leucociti) originano da cellule staminali ematopoietiche

Cellule del sistema immune

Linea mieloide e risposta innata CMP (common myeloid progenitor) dà origine a macrofagi, granulociti, mastociti, cellule dendritiche, megacariociti ed eritrociti Le cellule della risposta innata derivano dal CMP (nota: alcune cellule dendritiche originano dal CLP)

Macrofagi Derivano dai monociti che circolano nel sangue continuamente e poi migrano nei tessuti dove differenziano in macrofagi Insieme con I granulociti e le cellule dendritiche, costituiscono I fagociti del sistema immune Svolgono funzioni sia nella risposta innata che in quella adattativa Fagocitosi di microrganismi nella risposta innata, eliminazione di patogeni attaccati dalla risposta adattativa Presentano l’antigene alle cellule della risposta adattativa Oltre alla fagocitosi inducono la risposta infiammatoria e producono citochine regolatorie Aldilà della funzione nell’immunità, sono spazzini generali dei nostri tessuti

Granulociti Vita più breve dei macrofagi (pochi giorni), e vengono prodotti in maniera regolata aumentando durante episodi di infezione o infiammazione Fagociti anch’essi, svolgono un ruolo chiave nella risposta immune innata Inglobano molti microrganismi e poi li distruggono con le attività enzimatiche degradative conservate nei granuli citoplasmatici Importanza chiara da immunodeficienze dove sono gravemente ridotti o assenti, con infezioni batteriche graavi e frequenti

Basofili ed eosinofili Importanti primariamente nella difesa contro I parassiti, troppo grandi per essere fagocitati dai macrofagi e dai neutrofili Coinvolti nelle reazioni allergiche, di cui non parleremo nel corso di base

Mastociti Principalmente coinvolti in reazioni allergiche/infiammazione Proteggono le superfici interne del corpo contro microrganismi patogeni (vermi parassiti, per esempio)

Cellule dendritiche Hanno prolungamenti come I dendriti delle cellule neuronali Migrano dal midollo osseo attraverso il sangue ai tessuti Effettuano fagocitosi e macropinocitosi (ingestione di liquido extracellulare con il suo contenuto) Incontro con microrganismi: attivazione e maturazione con presentazione dell’antigene ai linfociti T Le più importanti antigen-presenting cells (APCs) Svolgono ruolo di cerniera fra risposta innata ed adattativa

Linea linfoide Linfociti B/T Origina dal common lymphoid progenitor (CLP) Linfociti B e T (risposta adattativa) Linfocita Natural Killer (risposta innata) Cellule infettate da virus Cellule tumorali I linfociti B e T sono antigene-specifici Esprimono recettori antigenici sulla superficie cellulare che si originano con un complesso meccanismo molecolare per garantire la variabilità necessaria per “captare” praticamente tutti I segnali estranei antigenici Prima di incontrare l’antigene sono piccole cellule inattive (dette “naïve”) Dopo l’incontro con l’antigene avviene la maturazione dei linfociti in linfociti “effettori” pienamente funzionali Linfociti B: dopo che un antigene ha legato un antigene presente su queste cellule (B-cell receptor o BCR), il linfocita prolifera e matura in una plasmacellula e secerne anticorpi (detti anche immunoglobuline o Ig) che sono la forma solubile del recettore di superficie Linfociti T: dopo che l’antigene lega il T-cell receptor (TCR) maturano in: Linfociti T citotossici: in grado di uccidere le cellule infettate da virus o batteri intracellulari Linfociti T helper: producono segnali (citochine) che stimolano le cellule B a produrre anticorpi, ed I macrofagi per stimolare la loro attività Linfociti T regolatori: sopprimono l’attività di altri linfociti e controllano e limitano la risposta immune Durante la risposta immune alcuni linfociti T e B diventato “cellule della memoria”, essenziali per una risposta più efficiente e rapida quando lo stesso antigene si ripresenta (principio alla base della vaccinazione, non discussa in questo corso di base) Linfociti B/T

I tessuti linfoidi Organi centrali Midollo osseo Organo dove maturano I linfociti B Timo Organo dove maturano I linfociti T Dopo la loro maturazione negli organi primari I linfociti entrano in circolo come linfociti naïve, e circolano nei tessuti linfoidi periferici dove entrano a contatto con l’antigene Organi periferici Linfonodi Milza Tessuti linfoidi mucosali Intestino Tratto aereo Mucosa urogenitale Etc.

La risposta immune innata

La prima linea di difesa In molti casi, I microrganismi potenzialmente patogeni vengono eliminati molto rapidamente dall’organismo grazie alla risposta immune innata Anche la risposta innata riconosce e distingue il “self” dal “non-self”, ma in maniera semplificata dal momento che per riconoscere il “non-self” utilizza un numero limitato di recettori, I “pattern-recognition receptors”

I “pattern-recognition receptors” della risposta immune innata I macrofagi, I neutrofili e le cellule dendritiche riconoscono molecole semplici e pattern strutturali molecolari presenti in molti microrganismi e detti “pathogen-associated molecular patterns “ (PAMPs), che non sono espressi dalle cellule del nostro corpo. I recettori per I PAMPs sono detti pattern-recognition receptors (PRRs), e riconoscono: Oligosaccaridi Peptidoglicani Lipopolisaccaridi DNA non metilato (il DNA delle cellule umane è metilato nella maggior parte dei residui CpG)

Le tre fasi della risposta ad un agente infettivo

Prima fase Effettuata da molecole pre-esistenti Enzimi anti-microbici come il lisozima attaccano la parete batterica Peptidi anti-microbici (defensine) lisano direttamente le membrane batteriche Proteine del plasma (complemento) facilitano lisi e fagocitosi da parte dei macrofagi

La funzione delle superfici epiteliali Cute e mucose sono una difesa molto importante Esempio: ferite molto più soggette ad infezioni Mucose producono muco che contiene molte glicoproteine dette mucine, che riducono l’adesione dei microrganismi alle cellule e facilitano la loro espulsione dal battito delle cilia delle mucose epiteliali Malattie in cui la produzione del muco è alterata portano a gravi infezioni Ruolo dei batteri commensali o microbiota. Sono batteri che svolgono un ruolo anche positivo per l’individuo che li ospita (simbiosi), e che producono sostanze antimicrobiche (batteriocine, acido lattico)

Barriere di difesa epiteliali

Le molecole antimicrobiche prodotte da epiteli-fagociti pH acido dello stomaco, acidi biliari, lipidi presenti nel tratto gastrointestinale sono una barriera chimica efficiente contro molti microrganismi Enzimi anti-batterici che attaccano la parete cellulare batterica Lisozima e fosfolipasi A2 (nelle lacrime, saliva, prodotti dai fagociti)

Lisozima Peptidoglicano: polimero di acetilglucosamina che si alterna a acido acetilmuramico, il tutto rinforzato da crosslinking peptidici Il lisozima è una glicosidasi che rompe un legame glicosidico presente nel peptidoglicano scindendo il loegame fra I due zuccheri Per questo è più efficace contro I batteri Gram-positivi, in cui il peptidoglicano è esposto, rispetto ai batteri Gram-negativi in cui lo strato esterno è rappresentato dal lipopolisaccaride (LPS) L’esposizione della membrana lipidica dopo distruzione del petidoglicano la rende attaccabile dalla fosfolipasi A2,

Peptidi antimicrobici Prodotti da cellule epiteliali e fagociti, si trovano nel fluido mucosale e nei tessuti Nei mammiferi ci sono tre classi principali: Defensine Catelicidine Istatine

Defensine Peptidi carichi di 30-40aa che presentano una regione carica positivamente separata da una regione idrofobica In pochi minuti distruggono le membrane cellulari di batteri, funghi e di alcuni virus, uccidendo il microrganismo La regione idrofobica s’inserisce nella membrana lipidica, quindi si forma un poro che fa perdere la permeabilità cellulare Nei neutrofili le difensine sono immagazzinate nei granuli; quando avviene la fagocitosi I granuli si fondono con le vescicole fagocitiche ed aiutano ad uccidere I batteri

Il sistema del complemento nella risposta innata Originariamente è stato identificato come una componente della risposta adattativa, ma gioca un ruolo anche nella risposta innata Costituito da circa 30 proteine prodotte per lo più dal fegato In assenza di infezione, queste proteine circolano nel sangue in forma inattiva In presenza di patogeni o di anticorpi legati ad agenti patogeni abbiamo il processo di attivazione del complemento 3 maniere diverse di attivazione del complemento L’attivazione avviene per proteolisi limitata, molte proteine del complemento sono proteasi che attivano altre proteasi

Le proteine del complemento Proteine inattive sono indicate con una lettera + numero: es. C1 Prodotti delle reazioni proteolitiche di attivazione sono indicati dall’aggiunta di una lettera minuscola: es. C3a e C3b Il suffisso “b” indica la subunità più grande Ci sono molte eccezioni!!!

Il complemento è un sistema di PRRs solubili e di molecole effettrici che riconosce e distrugge microrganismi Riconoscimento (varie modalità) Attivazione di C3 Fase effettrice

I fase Attivazione via lectine: MBL (mannose-binding lectin) o ficoline riconoscono carboidrati presenti sulla superficie esterna del microrganismo patogeno Attivazione “classica”: C1 (che comprende una PRR –C1q- e delle proteasi –C1r e C1s) riconosce un microrganismo direttamente o anticorpi che legano un microrganismo Attivazione “alternativa”: spontanea idrolisi della componente C3, che insieme ad altri fattori della via alternativa si lega direttamente alle superfici dei microrganismi

II fase Nella fase precedente si genera una attività di C3 convertasi (varia in funzione del pathway di attivazione), che cliva C3 per generare: C3b, componente chiave che si lega in maniera covalente alla superficie dei microrganismi ed agisce come opsonina, cioè facilita il riconoscimento del bersaglio da parte dei fagociti (che hanno recettori per C3b ed altre componenti del complemento) il legame covalente avviene grazie ad alcuni residui che vengono esposti solo dopo il clivaggio di C3 in C3b C3a, che viene rilasciato ed induce infiammazione

III fase Reclutamento di fagociti, opsonizzazione C3b+C3convertasi -> C5 convertasi che libera C5a (pro-infiammazione) e C5b che inizia gli eventi finali dell’attivazione del complemento, in cui con altre proteine forma il membrane-attack complex, che crea un poro nella membrana cellulare e così causa lisi cellulare

Regolazione del complemento Le componenti del complemento una volta attive devono essere legate alla superficie dei patogeni, altrimenti vengono rapidamente inattivate Esistono inoltre molte proteine regolatorie che impediscono l’attivazione inappropriata Cellule che stanno morendo possono attivare il complemento, e questo facilita la loro rimozione

Seconda fase Le cellule della risposta immune riconoscono I PAMPs e vengono attivate, mettendo in atto molti meccanismi di eliminazione dell’agente patogeno Se ciò riesce, si ha risoluzione dell’infezione senza memoria

Le cellule della risposta immune innata e la “pattern recognition” PRRs (pattern recognition receptor) sono divisi in 4 gruppi: Recettori solubili (come MBL) Recettori dei fagociti membrana-associati Recettori di segnalazione membrana-associati Recettori di segnalazione citoplasmatici

Diversità dei recettori fra immunità innata ed adattativa

I fagociti Quando I microrganismi passano la barriera epiteliale, si trovano a dover affrontare l’attacco dei fagociti 3 classi Macrofagi Granulociti Cellule dendritiche

Macrofagi I Monociti (sangue circolante) migrano nei tessuti e maturano in macrofagi I macrofagi hanno avuto vari nomi a seconda del tessuto (microglia nel sistema nervoso, cellule di Kupfer nel fegato…) Sono particolarmente abbondanti nel connettivo dei vari organi

Granulociti e cellule dendritiche Neutrofili Maggiore potenziale fagocitario Eosinofili e Basofili Cellule dendritiche Convenzionali: fagocitano ma il loro ruolo principale non è l’eliminazione degli agenti patogeni ma quello di processare molecole provenienti dal patogeno per generare antigeni peptidici in grado di stimolare la risposta immune adattativa dei linfociti T Plasmocitoidi: produttori di citochine (interferoni) antivirali, considerate come facenti parte della risposta innata

Riconoscimento degli agenti patogeni I fagociti esprimono diversi recettori di superficie in grado di riconoscere agenti patogeni direttamente, o mediante riconoscimento del complemento Tra questi recettori alcune lectine in grado di riconoscere carboidrati batterici, ed altri recettori per lipidi e lipoproteine batteriche

Fagocitosi Il patogeno viene inglobato all’interno del fagocita dopo una invaginazione della membrana plasmatica, a formare una vescicola che contiene il patogeno detta fagosoma Il fagosoma si acidifica e questo porta già alla morte di molti patogeni A questo punto c’è la fusione con I lisosomi (nei granulociti con I granuli che contengono varie molecole antimicrobiche) a formare il fagolisosoma che porta all distruzione dei microrganismi Importante è anche la produzione di ROS ed altre molecole ossidanti dai fagociti (vedi dopo) Nelle cellule dendritiche I patogeni possono essere anche captati in maniera aspecifica per macropinocitosi

Recettori per il signaling intracellulare Oltre ai recettori per la fagocitosi, le cellule della risposta innata presentano anche recettori della superfamiglia GPCR (G-protein coupled receptor) che hanno funzione di signaling Recettore fMet-Leu-Phe (fMLP ) riconosce un particolare aminoacido (formil-metionina) che è presente nei batteri ma non nelle cellule eucariotiche, il recettore quindi “sente” la presenza dei batteri e stimola la migrazione dei macrofagi e neutrofili verso la regione con la massima concentrazione di peptidi contenenti questo aminoacido Oltre alla migrazione verso l’agente patogeno l’attivazione di fMLP induce anche la produzione di molecole antimicrobiche, incluso I ROS (“burst” respiratorio)

Recettori per il signaling intracellulare

Il burst respiratorio

Burst respiratorio Nei neutrofili non attivati, le subunità dell’enzima NADPH ossidasi sono localizzate in compartimenti cellulari diversi Granuli Citoplasma Dopo l’attivazione di fMLP-Rac2, le subunità si riassemblano sulla superficie del fagolisosoma NADPH trasferisce un elettrone dal FAD (suo cofattore) all’ossigeno a formare superossido, che attraverso altre reazioni contribuisce all’attivazione di altri enzimi del fagolisosoma ed al killing dei patogeni (conversione in acqua ossigenata ed ipoclorito)

Interazione patogeno-ospite: Reazione infiammatoria L’infiammazione: Favorisce il reclutamento di cellule immuni (neutrofili, macrofagi) dal sangue al sito di infiammazione Favorisce coagulo locale che “blocca” l’infezione Favorisce il riparo del tessuto danneggiato Segue capitolo sull’infiammazione

Terza fase Se le prime due linee di difesa effettuate nelle prime due fasi non sono sufficienti e la infezione continua, inizia la risposta immune adattativa