Arrays di acidi nucleici

A B C D mRNA 1 a b g d 2 e z h q 3 i k l m cDNA 4 n x o p Sia i macroarrays che i microarrays sono stati sviluppati per soddisfare l’esigenza di misurare contemporaneamente l’espressione di più geni. Entambe le tecnologie si basano sullo stesso principio: 2. L’array viene ibridizzato con una miscela complessa di molecole marcate rappresentative dell’mRNA espresso dalle cellule in esame 1. Come sonda si usano olgonucleotidi o molecole di cDNA non marcati, immmobilizzati in posizioni precise di un supporto solido A B C D mRNA 1 a b g d 2 RT Nucleotidi marcati e z h q 3 i k l m cDNA 4 n x o p Array

I saggi di microarray sono basati sul principio dell’ibridazione inversa

Macrorray Le molecole sonda vengono legate a membrane di nylon Come tracciante viene utilizzata la radioattività Analisi di qualche decina o poche centinaia di geni

Microrray: tecnologia Affymetrix Le molecole sonda sono oligonucleotidi sintetizzati direttemente su microchip di silicio con un metodo fotolitografico. Su ogni microchip vengono sintetizzati fino a 400000 oligonucleotidi diversi. La metodica è stata sviluppata in modo da permettere misurazioni assolute dell’abbondanza dei singoli mRNA

TGAACTGATAGATGACGTAG Schema metodica mRNA TGAACTGATAGATGACGTAG Poly A Poly A Design complementary oligo ACTTGACTAT C T AC TG CATC Chemically synthesize oligo on chip 107- 108 identical oligos per feature Label – Label – Hybridize labeled total mRNA Detect label

Thousands of identical probes/feature Microrray: tecnologia Affymetrix 50µm ~ 50 - 400 chips/wafer Thousands of identical probes/feature 1.28cm 1.28cm up to ~ 400,000 features/chip

Sintesi fotolitografica Lamp Mask Chip

107-108 identical probes/feature Ibridazione e rivelazione Phycoerythrin Streptavidin Phycoerythrin Streptavidin Biotin Biotin Biotin 107-108 identical probes/feature

Rappresentazione di ogni trascritto sul chip Perfect Match mRNA * * * * * * Mismatch Perfect Match Mismatch Per ogni gene vengono sintetizzati 20 oligonucleotidi uguali all’mRNA (perfect match). Per ognuno di questi, ne viene sintetizzato un altro con una base sbagliata (mismatch). L’espressione del gene si ottiene sommando le letture dei perfect match e sottraendo quelle dei mismatch. Questi accorgimenti sono indispensabili per eliminare i problemi dovuti alla eventale ibridizzazione disugule o non specifica degli oligonucleotidi.

Letture possibili Detectable Undetectable Undetectable Perfect Match Mismatch Undetectable Undetectable

PIN

PRINTING

INK JET PRINTING

cDNA Microarray

Modalità di marcatura

Modalità di marcatura

Microrray di cDNA (o di oligonucleotidi lunghi) Le molecole sonda sono cDNA o oligonucleotidi lunghi 70-80 paia di basi, sintetizzati tradizionalmente e egati ad un vetrino da microscopio per mezzo di un processo di stampa a getto. Su ogni vetrino trovano posto fino a 20000 geni. L’intensità del segnale per ogni gene dipende dai livelli di messaggero e dall’efficienza di ibridazione. Pertanto questa metodica non consente misurazioni assolute ma solo relative. Metodica comparativa. Per confrontare tra di loro più campioni è necessario confrontarli tutti con un campione standardizzato.

mRNA mRNA Reverse Reverse Labeled Labeled transcription transcription 1 1 st st strand strand cDNA cDNA Sample 1 (test) Sample 2 (reference) Hybridization on the Hybridization on the cDNA microarray cDNA microarray

Bead Arrays

Analisi statistica a tutti i livelli Identificazione degli spot

Analisi statistica a tutti i livelli Eliminazione degli artefatti

Analisi statistica a tutti i livelli Normalizzazione

Analisi statistica a tutti i livelli Identificazione dei geni modulati

Analisi statistica a tutti i livelli Clustering dei dati

Analisi statistica a tutti i livelli Clustering dei dati

Attenzione !!! L’enorme numero di geni analizzati dai microarray è il punto più forte, ma anche più debole della metodica. Infatti sono possibili moltissimi errori (importanza di avere campioni replicati), e il trattamento dell’informazione non è banale! L’acquisizione dei dati è solo la parte iniziale della procedura. La parte più complicata è l’elaborazione della enorme quantità di dati generati da questi esperimenti, necessaria per rispondere ai quesiti biologici di partenza. I dati più significativi devono essere poi verificati con altri sistemi (northern, real time RT-PCR)

Importanza della bioinformatica per la determinazione del significato biologico degli esperimenti

Applicazioni Definizione delle basi molecolari e identificazione di nuovi markers prognostici per neoplasie e altre patologie

Applicazioni Definizione delle basi molecolari e identificazione di nuovi markers prognostici per neoplasie e altre patologie

Applicazioni Studio del controllo trascrizionale. In particolare, identificazione dei siti di legame per i fattori trascrizionali coinvolti nella coregolazione

Applicazioni

Applicazioni Annotazione del genoma, ossia identificazione delle regioni effettivamente trascritte

Farmacogenomica e tossicogenomica Applicazioni Farmacogenomica e tossicogenomica