L’isolamento virale: aspetti innovativi A.Azzi Firenze, 19/11/2004

Le colture cellulari Le colture cellulari Colture primarie Colture primarie Linee continue In monostrato In sospensione Primo passaggio di cellule ottenute dalla disaggregazione di un tessuto espiantato Rappresentative del tessuto d’origine Laboriose da preparare Molto variabili

Le colture cellulari Colture primarie Linee continue Linee continue In monostrato In sospensione linee di cellule trasformate e immortalizzate per mutazione spontanea o indotta da carcinogeni chimici radiazioni ionizzanti infezione in vitro con agenti immortalizzanti.

Le colture cellulari Linee subcontinue: possono essere subcoltivate per un limitato numero di passaggi dopo la coltura primaria, prime del fenomeno di senescenza mantengono il fenotipo normale

Le colture cellulari Colture primarie Linee continue In monostrato Aderenti al supporto Es HeLa, Hep-2, KB, MRC 5 WI38 ……….. Colture primarie Linee continue In monostrato In sospensione

Rene di coniglio

Fibroblasti di polmone umano

Hep-2

Fornitori di colture cellulari ATCC American Type Culture Collection http://www.atcc.org ECACC European Collection of (Animal) Cell Culture http://www.camr.org.uk/ecacc.htm/ DSMZ Deutsche Sammlung vov Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH http://www.dsmz.de/ Centro Substrati Cellulari-Istituto Zooprofilattico di Brescia http:/www.bs.izs.it

I terreni per le colture cellulari Terreni di crescita + siero bovino fetale al 10 % Terreni di mantenimento + siero bovino fetale al 2 % Terreni serum-free Principali componenti Sol. salina bilanciata Sistemi tampone (bicarbonato/CO2, Hepes) Carboidrati o glutamina Aminoacidi Vitamine Ormoni e fattori di crescita Proteine e peptidi Acidi grassi e lipidi Fattori accessori (tracce di elementi, nucleotidi) Antibiotici ???

La coltura tradizionale Asportazione del terreno Lavaggi Inoculazione del campione (pre-trattato) Adsorbimento (incubazione x 1 ora a 37°C) Asportazione dell’inoculo Aggiunta del terreno di mantenimento Incubazione per giorni, fino a comparsa dell’ECP Identificazione del virus e tipizzazione

Limite dei sistemi tradizionali di isolamento Esperienza Tempo Necessità di mantenere diverse linee

Shell vial

Inoculazione in shell vials

Linee cellulari per l’isolamento di virus Alcune linee “particolari” HCE (human corneal epithelial): da coltura primaria da donatore cornea cellule immortalizzate con vettore ricombinante SV 40-adenovirus per HSV-1 Linea B95-8: linea linfoblastoide trasformata da EBV Per virus del morbillo

Valutazione della linea Inoculazione campioni (corneal scraping) in shell vials di HCE e Vero Incubazione 12-24 ore IF con sieri policlonalianti-HSV-1 Valutazione qualitativa = presenza di cellule con IF specifica Valutazione quantitativa = n° foci IF in ciascun preparato (shell vial)

Risultato Vero: 4 pos /17 HCE: 10 pos /17

HCE monostrato

HCE cells ECP

ECP in shell vial

IF su HCE infettate con HSV 1

Colture cellulari Transgenic cell lines for detection of animal viruses Olivo 1996

Espressione di recettori virali Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of poliovirus in vitro. Pipkin et al 1993

Cellule transgeniche che favoriscono l’individuazione del virus

Rapid detection of HSV with an enzyme-linked virus inducible system (ELVIS) employng a genetically modified cell line Profitt and Schindler 1995

Isolamento dei virus respiratori Influenza A Influenza B Virus respiratorio sinciziale V.parainfluenzale 1 V.parainfluenzale 2 V.parainfluenzale 3 Adenovirus

Isolamento di virus respiratori Necessità di allestire colture con diverse linee cellulari Coltura tradizionale Centrifugation-enhanced shell vial culture Coltura simultanea di più linee cellulari R-Mix e R-Mix shell vial Hep-2, LLC-MK2, MDCK su vetrino Inoculazione Centrifugazione a 700 x g Incubazione per 16-24 ore e 40-48 ore Hep-2, LLC-MK2, MDCK :sospensione mista contenente 50.000 cellule di ciascuna linea /vetrino Inoculazione Incubazione per 48 ore IF con pool monoclonali 1

Coltura simultanea di più linee cellulari 2 IF 7 diversi monoclonali: Flu A, Flu B, RSV, Para 1,Para 2, Para 3, Ad

R-MIX Shell vial: cellule di polmone di visone (ceppo Mv1Lu) e cellule di adenocarcinoma umano (A549) Inoculazione Centrifugazione (1 ora a 700x g) Incubazione per 24 ore - 48ore IF

Isolamento dei virus respiratori La coltura tradizionale a tempi lunghi rimane il test di riferimento IFD < CM < CT

Monostrati di cellule criopreservati HELVIS R-mix Stabili a -80°C per oltre 4 mesi