Sistema di ricerca Entrez Insieme di banche dati contenenti svariati tipi di informazioni biomediche, interrogabile mediante un’unica interfaccia Concetto fondamentale: integrazione

Esempio di interrogazione PubMed Esercitazione 1: trovare articoli recenti e non troppo specialistici sulla proteina p53. Dopo averne scelto uno, identificare i documenti correlati esistenti nel database Esercitazione 2: trovare articoli recenti e ad elevato impatto pubblicati sulla proteina p53 da laboratori italiani Esercitazione 3: trovare gli articoli più importanti pubblicati su Nature, Cell o Science negli ultimi tre anni.

Come orientarsi nei database di sequenze? Miliardi di basi sequenziate Elevata ridondanza nei diversi database Sequenze di qualità molto variabile, sia per ciò che riguarda l’informazione primaria che per l’annotazione

Sequenziamento delle sole regioni esoniche (Expressed Sequence Tags) cDNA-library plasmidica direzionale Picking singoli cloni Preparazione DNA Primer 5’ 3’ Sequenziamento automatico Deposito in banca dati ( bp)

AAAAAAAA mRNA (10 copie di cDNA nella library) ESTTratto non sequenziato del clone Inserti

Come orientarsi nei database di sequenze? Esercitazione 4: trovare con un’unica ricerca sequenze di cDNA ben annotate corrispondenti a geni implicati nel cancro del colon. Esercitazione 5: scegliere una sequenza e identificare le sequenze simili presenti nella banca dati. Esercitzione 6: analisi in silico dell’espressione genica

Principali database di sequenze GeneBank (Nucleotide, Protein) Unigene RefSeq Locus link (problema dei nomi molteplici) Entrez Gene Genome Structure

Allineamento di sequenze Perché è importante? Le caratteristiche funzionali delle molecole biologiche dipendono dalle conformazione tridimensionale che gli atomi costituenti assumono nello spazio. Questa a sua volta dipende dalla sequenza delle unità elementari (in genere si tratta di aminoacidi, ma lo stesso discorso vale anche per i nucleotidi). Molecole che hanno sequenza primaria simile tendono ad avere strutture secondarie e terziarie simili. Se due proteine sono identiche al 50%, è altamente probabile che la loro struttura tridimensionale sia quasi completamente sovrapponibile.

Sequenze identiche al 62% Chymotrypsin MLGITVLAALLACASSCGVPSFPPNLSARVVGGEDARPHSWPWQISLQYLKNDTWRHTCG :..:..:.: : ::: :..::.. ::::::.:::.:::::.::::.: : :::: Elastase MIRTLLLSTLVAGALSCGDPTYPPYVT-RVVGGEEARPNSWPWQVSLQYSSNGKWYHTCG Chymotrypsin GTLIASNFVLTAAHCISNTRTYRVAVGKNNLEVEDEEGSLFVGVDTIHVHKRWNALLLR- :.:::...:::::::::..:::::..:..:: : : ::: :.:. : ::: ::.. Elastase GSLIANSWVLTAAHCISSSRTYRVGLGRHNLYVA-ESGSLAVSVSKIVVHKDWNSNQISK Chymotrypsin -NDIALIKLAEHVELSDTIQVACLPEKDSLLPKDYPCYVTGWGRLWTNGPIADKLQQGLQ :::::.:::. : :.: ::.::::..::..::::::::::: :::. : :::: Elastase GNDIALLKLANPVSLTDKIQLACLPPAGTILPNNYPCYVTGWGRLQTNGAVPDVLQQGRL Chymotrypsin PVVDHATCSRIDWWGFRVKKTMVCAGGDGVISACNGDSGGPLNCQLENGSWEVFGIVSFG :::.:::: ::: ::.:.:::::::::.::::::::::::.: :.: :::::: Elastase LVVDYATCSSSAWWGSSVKTSMICAGGDGVISSCNGDSGGPLNCQASDGRWQVHGIVSFG Chymotrypsin SRRGCNTRKKPVVYTRVSAYIDWINEKM-QL :: :::.:: :.:::: ::::::.. Elastase SRLGCNYYHKPSVFTRVSNYIDWINSVIANN

Sequenze identiche al 62%

Allineamento globale e allineamento locale Alcuni programmi, date due sequenze, generano in ogni caso l’allineamento migliore possibile tra di esse, su tutta la lunghezza. Questo tipo di allineamento prende il nome di allineamento globale. Non necessariamente un allineamento globale ha significato biologico. Altri programmi, date due sequenze, non le allineano necessariamente su tutta la lunghezza, ma vanno a cercare soltanto i tratti in cui l’omologia tra le due sequenze (ossia lo score) supera una certa soglia. In questi si parla di allineamento locale.

Come funziona BLAST? La sequenza di cui si vogliono trovare gli omologhi viene scomposta in tutte le possibili parole di una lunghezza prefissata (ad esempio due o tre se si tratta di aminoacidi) MLFFRRQPKHCSDTEF MLFLFFFFRFRRRRQRQPQPK PKHKHCHCSCSDSDTDTETEF Le parole di tre lettere vengono quindi cercate in tutte le sequenze della banca dati (operazione estremamente rapida)

Query: MLFFRRQPKHCSDTEF MLFLFFFFRFRRRRQRQPQPK PKHKHCHCSCSDSDTDTETEF Subject: ASDDERTGLFDRKQPKACMDSEFKATT QPK ::: In seguito l’allineamento viene esteso HCSDTEF : :.: MLFFRR :: :. Subject: ASDDERTGLFDRKQPKACMDSEFKATT QPK ::: Query:

Gapped BLAST

Versioni disponibili del programma Blast BlastN = ricerca in un database di sequenze nucleotidiche le sequenze omologhe ad una sequenza nucleotidica data. BlastP = ricerca in un database di sequenze aminoacidiche le sequenze omologhe ad una sequenza aminoacidica data. BlastX = data una sequenza nucleotidica, la traduce in tutte e sei le possibili cornici di lettura (traduzione dinamica), e cerca le seqeunze omologhe alle traduzioni in un database di sequenze aminoacidiche tBlastN = data una sequenza aminoacidica, la confronta con tutte le possibili traduzioni di un database di sequenze nucleotidiche. tBlastX = data una sequenza nucleotidica, confronta la sua traduzione dinamica con tutte le possibili traduzioni di un database di sequenze nucleotidiche.

ATA SSGGYRKGVTEAKLKVAINGFGRIGRNFLRCWHGRKDSPLDIIAIND-TGGV 99 ATB AQIIPKAVTTSTPVRGETVAKLKVAINGFGRIGRNFLRCWHGRKDSPLEVVVLND-SGGV 119 HS MG--KVKVGVNGFGRIGRLVTRAAF--NSGKVDIVAINDPFIDL 40 MM MVKVGVNGFGRIGRLVTRAAI--CSGKVEIVAINDPFIDL 38 XL MVKVGINGFGCIGRLVTRAAF--DSGKVQVVAINDPFIDL 38 DM MSKIGINGFGRIGRLVLRAAI--DKG-ANVVAVNDPFIDV 37 CE MS--KANVGINGFGRIGRLVLRAAV--EKDTVQVVAVNDPFITI 40 SP MA--IPKVGINGFGRIGRIVLRNAI--LTGKIQVVAVNDPFIDL 40 ATC MADKKIRIGINGFGRIGRLVARVVL--QRDDVELVAVNDPFITT 42 OS MG--KIKIGINGFGRIGRLVARVAL--QSEDVELVAVNDPFITT 40 SC MVRVAINGFGRIGRLVMRIAL--SRPNVEVVALNDPFITN 38 ECA MTIKVGINGFGRIGRIVFRAAQ--KRSDIEIVAIND-LLDA 38 HI MAIKIGINGFGRIGRIVFRAAQ--HRDDIEVVGIND-LIDV 38 ECC MSKVGINGFGRIGRLVLRRLL-EVKSNIDVVAIND-LTSP 38.:.:**** ***. * ::: :**. ATA KQASHLLKYDSTLGIFDADVKPSGETAISVD-----GKIIQVVSNRNPSLLPWKELGIDI 154 ATB KNASHLLKYDSMLGTFKAEVKIVDNETISVD-----GKLIKVVSNRDPLKLPWAELGIDI 174 HS NYMVYMFQYDSTHGKFHG-TVKAENGKLVIN-----GNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEY 94 MM NYMVYMFQYDSTHGKFNG-TVKAENGKLVIN-----GKPITIFQERDPTNIKWGEAGAEY 92 XL DYMVYMFKYDSTHGRFKG-TVKAENGKLIIN-----DQVITVFQERDPSSIKWGDAGAVY 92 DM NYMVYLFKFDSTHGRFKG-TVAAEGGFLVVN-----GQKITVFSERDPANINWASAGAEY 91 CE DYMVYLFKYDSTHGQFKG-TVTYDGDFLIVQKDGKSSHKIKVFNSKDPAAIAWGSVKADF 99 SP DYMAYMFKYDSTHGRFEG-SVETKGGKLVID-----GHSIDVHNERDPANIKWSASGAEY 94 ATC EYMTYMFKYDSVHGQWKHNELKIKDEKTLLFG----EKPVTVFGIRNPEDIPWAEAGADY 98 OS DYMTYMFKYDTVHGQWKHSDIKIKDSKTLLLG----EKPVTVFGIRNPDEIPWAEAGAEY 96 SC DYAAYMFKYDSTHGRYAG-EVSHDDKHIIVD-----GKKIATYQERDPANLPWGSSNVDI 92 ECA DYMAYMLKYDSTHGRFDG-TVEVKDGHLIVN-----GKKIRVTAERDPANLKWDEVGVDV 92 HI EYMAYMLKYDSTHGRFDG-TVEVKDGNLVVN-----GKTIRVTAERDPANLNWGAIGVDI 92 ECC KILAYLLKHDSNYGPFPW-SVDFTEDSLIVD-----GKSIAVYAEKEAKNIPWKAKGAEI 92. ::::.*: * : : : : ::. : * Allineamento multiplo generato dal programma CLUSTALW

Caratteristiche di famiglie di proteine derivabili da allineamenti multipli: Profilo= rappresentazione numerica dell’allineamento che valuta: a)Quali residui sono presenti in ogni posizione e con quale frequenza. b)Presenza di residui assolutamente conservati. c)Presenza di eventuali gap. Dagli allineamenti multipli si possono costruire delle position-specific scoring tables (PSST), che riflettono la probabilità di trovare un certo aminoacido in ogni posizione.

Caratteristiche di famiglie di proteine derivabili da allineamenti multipli: Pattern= rappresentazione dell’allineamento che valuta unicamente la presenza di determinati residui per ogni posizione. [IV]-G-x-G-T-[LIVMF]-x(2)-[GS] Motivo= sequenza conservata di aminoacidi che conferisce una specifica funzione o struttura. Blocco= regione conservata di un allineamento multiplo priva di gaps.

Analisi di domini conservati PFAM: database di allineamenti multipli e HMMs ProfileScan: HMMER: costruzione di HMMs e ricerca di database BLOCKS: CDD search:

Mutazioni e polimorfismi: OMIM e SNPs

Browsers genomici e genomica integrativa