Dr. F. Andretta, Dr.sa S. Baldini, Dr.sa S. Ricchi L'accreditamento di un laboratorio di analisi ambientali: esperienze della SoPrA - Sangalli Protezioni Ambientali srl Dr. F. Andretta, Dr.sa S. Baldini, Dr.sa S. Ricchi 1

SoPrA Sangalli Protezioni Ambientali srl Milano Numero di accreditamento Sinal 0517 Analisi su matrici ambientali: acque, terreni, rifiuti, emissioni, aria in ambienti di lavoro. Accreditamento di metodi normati (APAT CNR IRSA, EPA, UNI) Accreditamento di metodi interni LABORATORIO ASSOCIATO AD ALA Verona, 23 Ottobre 2007 2

Definizione di validazione VALIDAZIONE = è la conferma attraverso esame e l’apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l’utilizzazione prevista sono soddisfatti (5.4.5.1 UNI CEI EN ISO/IEC 17025, DG-0007 Sinal) Verona, 23 Ottobre 2007 3

Quando validare un metodo Metodi non normalizzati Metodi sviluppati/progettati dal laboratorio Metodi normalizzati utilizzati al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione prefissato Estensioni e modifiche di metodi normalizzati Estensioni e modifiche di metodi normalizzati PER CONFERMARE CHE I METODI SIANO ADATTI ALL’UTILIZZAZIONE PREVISTA. (5.4.5.2 UNI CEI EN ISO/IEC 17025, DG-0007 Sinal) Verona, 23 Ottobre 2007 4

Tecniche di validazione Taratura utilizzando campioni o materiali di riferimento Confronto dei risultati ottenuti con altri metodi Confronti interlaboratorio Valutazione sistematica dei fattori che influenzano il risultato Stima dell’incertezza dei risultati sulla base di una conoscenza dei principi teorici del metodo e di un’esperienza pratica UNA O COMBINAZIONE DELLE SEGUENTI TECNICHE (5.4.5.1 UNI CEI EN ISO/IEC 17025, DG-0007 Sinal) Verona, 23 Ottobre 2007 5

Parametri tecnici di validazione Selettività Limite di rilevabilità Limite di quantificazione Intervallo di lavoro ed intervallo di linearità Precisione (ripetibilità e riproducibilità) SELETTIVITA’= capacità di una tecnica analitica di non risentire della presenza di interferenti o d’altri componenti diversi dall’analita in esame. Talvolta in alternativa viene usato il termine SPECIFICITA’. LIMITE DI RILEVABILITA’= la più bassa concentrazione o valore della proprietà valutata, che può essere rilevato con un certo grado di sicurezza, ovvero con una certa probabilità di commettere un errore. LIMITE DI QUANTIFICAZIONE= Concentrazione minima di analita che può essere determinata con un accettabile livello di precisione (ripetibilità), stabilito dal laboratorio e successivamente verificato. Il limite di quantificazione rappresenta un livello dove la quantificazione è possibile da realizzare, ma il grado di incertezza associato alla misura quantitativa è estremamente alto. In questi casi la variabilità è tale che il valore di concentrazione riscontrato è paragonabile al valore di incertezza misurato. INTERVALLO DI LAVORO ED INTERVALLO DI LINEARITA’= Per ogni metodo quantitativo è necessario stabilire l’intervallo di concentrazione dell’analita entro il quale il metodo è applicabile. All’estremo inferiore di concentrazione i fattori limitanti sono il limite di rilevabilità ed il limite di quantificazione. All’estremo superiore dell’intervallo di concentrazione sono importanti le limitazioni dei vari effetti dipendenti dal sistema di risposta dello strumento. PRECISIONE= Espressione quantitativa, in termini di scarto tipo, di quanto i risultati di una stessa misura ripetuta sono vicini tra di loro. Le grandezze più comuni per descrivere la precisione sono la ripetibilità e la riproducibilità. (“Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell’incertezza di misura” – I manuali di Arpa) Verona, 23 Ottobre 2007 6

Parametri tecnici di validazione Accuratezza (esattezza) Sensibilità Robustezza Recupero Incertezza ESATTEZZA= l’esattezza misura quantitativamente quanto vicino al valore vero si posiziona la media di una serie di misure ed è normalmente espressa in termini di “BIAS”. Per valutarla si può: -         utilizzare materiali di riferimento certificati. Si esegue un test statistico chiamato t-test (probabilità del 95%) per valutare se i risultati sono accurati. -         determinare i valori di una matrice incognita, utilizzando un metodo di riferimento. Per il confronto si usa il test F sulle varianze (probabilità del 95%) e, dopo esito positivo, si applica il t-test per il confronto tra le medie; si calcola quindi lo scostamento dei valori, considerando come valore vero quello ottenuto con il metodo di riferimento. -         Se non sono disponibili matrici certificate né metodi di riferimento normati per il confronto: si può determinare l’esattezza del metodo utilizzando un materiale di riferimento preparato in laboratorio. SENSIBILITA’= Gradiente della curva di taratura, cioè la variazione di risposta strumentale che corrisponde ad una variazione di concentrazione dell’analita. ROBUSTEZZA= Capacità posseduta da un metodo di non essere influenzato significativamente, in termini di risultati finali, per effetto di variazioni deliberate, introdotte nelle sue fasi di realizzazione. Può essere intesa come l’efficienza di un metodo e il modo in cui le sue prestazioni si adeguano ad una non perfetta situazione analitica. RECUPERO= misura l’esattezza del metodo: si verifica l’efficienza del metodo nel determinare tutto l’analita presente. -         operare su aliquote da saggio contenenti l’analita a concentrazioni conosciute , estrarre l’analita dalla matrice e misurarne il recupero. Se si deve operare su più livelli si ripete l’operazione su matrici contenenti concentrazioni diverse. Il miglior modo è usare materiali di riferimento certificati. INCERTEZZA= parametro associato al risultato di una misurazione, che caratterizza la dispersione dei valori ragionevolmente attribuibili al misurando (UNI CEI ENV 13005) (“Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell’incertezza di misura” – I manuali di Arpa) Verona, 23 Ottobre 2007 7

CASO SPECIFICO: VALIDAZIONE DI UN METODO INTERNO Determinazione di H2S in flussi gassosi convogliati in concentrazione > 0,20 mg/Nm3 Metodo UNICHIM n. 634:84 Applicabile a concentrazioni > 10 mg/m3 necessità di creare un metodo interno Necessità del laboratorio: determinazione di H2S in flussi gassosi convogliati in concentrazione > 0,20 mg/Nm3 Problema: Metodo normato UNICHIM n. 634:84 Applicabile a concentrazioni > 10 mg/m3. Limite di quantificazione elevato Verona, 23 Ottobre 2007 8

Creazione di un metodo interno MI 04 rev 1 2007 Combinazione di due metodi normati Campionamento: UNICHIM n. 634:84 Analisi: APHA Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater ed 20th 1998, 4500-S2- D “Methylene Blue Method” Verona, 23 Ottobre 2007 9

MI 04 rev 1 2007 Scopo: determinazione del solfuro di idrogeno in flussi gassosi convogliati. Metodo di campionamento manuale e metodo di analisi colorimetrico. Principio del metodo: Assorbimento del solfuro di idrogeno per gorgogliamento del flusso gassoso in una soluzione di acetato di zinco e determinazione colorimetrica mediante spettrofotometro UV-VIS. Campo di applicazione: Il presente metodo consente la determinazione del solfuro di idrogeno in flussi gassosi convogliati in concentrazione superiore a 0,20 mg/Nm3 Verona, 23 Ottobre 2007 10

Validazione del MI 04 rev 1 2007 Tecnica di validazione: confronto dei risultati ottenuti con altri metodi normati Campionamento: il campionamento descritto nel metodo interno coincide con quello descritto nel metodo Unichim n. 634:84 “Misure alle emissioni. Flussi gassosi convogliati. Determinazione del solfuro di idrogeno – Metodo volumetrico” Si considera quindi che la fase di campionamento sia validata. Analisi: la validazione del procedimento d'analisi è stata effettuata per confronto con il metodo normato Unichim n. 634:84 “Misure alle emissioni. Flussi gassosi convogliati. Determinazione del solfuro di idrogeno – Metodo volumetrico” Verona, 23 Ottobre 2007 11

Validazione del MI 04 rev 1 2007 Validazione del procedimento di analisi: confronto con il metodo normato Unichim n. 634:84 mg/l S-- limite di rilevabilità (bianco + 3S) 0,01 limite di quantificazione (bianco + 10S) 0,02 range di lavoro 0,05 - 2,05 range di linearità 0,05 - 5,00 Verona, 23 Ottobre 2007 12

Validazione del MI 04 rev 1 2007 Sono state effettuate le prove su 3 differenti campioni: campione preparato in laboratorio con standard di riferimento di Sodio Solfuro UltraScientific lotto n. H00204; campionamento di H2S sulla canalizzazione che raccoglie biogas proveniente da impianto di trattamento e depurazione di acque; campionamento di H2S sulla canalizzazione che raccoglie biogas proveniente da discarica (a monte della torcia per la combustione). Verona, 23 Ottobre 2007 13

Validazione del MI 04 rev 1 2007 CAMPIONE 1 CAMPIONE 2 CAMPIONE 3 Met.rif MI Concentrazione (mg/l S--) 2,05 +/- 0,006 704 744 41,9 45,0 Ripetibilità (CVr%) 4,56 1,60 9,58 2,35 9,82 3,78 Recupero 98,9% 99,1% Esattezza del metodo Metodo esatto Confronto tra varianze (test F) differenza tra varianze statisticamente non significativa differenza tra varianze statisticamente significativa Confronto tra risultati (test t) differenza tra risultati medi statisticamente non significativa COMMENTI ALLA TABELLA CAMPIONE 1 E’ stato preparato un materiale di riferimento in laboratorio: alla soluzione di assorbimento è stato aggiunto un quantitativo di standard di sodio solfuro tale da ottenere una concentrazione di 2 mg/l S--. Questa concentrazione corrisponde al limite di quantificazione del metodo di riferimento (Unichim 634). Per questo campione è stato possibile determinare il recupero e verificare l’esattezza del metodo interno e del metodo di riferimento. LUCIDO 15 CAMPIONI 2 e 3 Sono dei campioni compositi creati a partire da una miscela di campioni reali. La concentrazione reale di questi campioni è incognita per cui non si è potuta determinare l’esattezza del metodo. RIPETIBILITA’ Il metodo Unichim non riporta dati di ripetibilità. I dati presentati sono riferiti alle prove eseguite in laboratorio. CONFRONTO TRA VARIANZE Permette di stabilire se le varianze di due campioni differiscono solo per fluttuazioni statistiche o se invece sono significativamente differenti. LUCIDO 16 CONFRONTO TRA RISULTATI E’ stato utilizzato il test t per valutare se il valore medio ottenuto dall’analisi del campione con il metodo interno differisce dal valore ottenuto con il metodo di riferimento solo a causa di fluttuazioni statistiche, o se invece esistono errori sistematici. LUCIDO 17, 18, 19 Verona, 23 Ottobre 2007 14

Esattezza del metodo CCRM = valore del materiale di riferimento X = valore medio delle n prove di ripetibilità Srip = scarto tipo di ripetibilità n = numero di prove utilizzate per la ripetibilità uCRM = incertezza tipo composta (o scarto tipo di riproducibilità o scarto tipo derivante dall’intervallo di confidenza) del materiale di riferimento RITORNARE A DIAPOSITIVA 14 (“Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell’incertezza di misura” – I manuali di Arpa) Verona, 23 Ottobre 2007 15

Confronto tra varianze – Test F Test F di Fisher-Snedecor Ho: S12 = S22 La differenza tra i valori non è significativa, cioè è dovuta solo a fluttuazioni statistiche Se l’ipotesi nulla verrà scartata, si dovrà accettare l’ipotesi alternativa, secondo la quale S12  S22 Livello di significatività  (di solito =5% o =1%) F = S12/ S22 con S12  S22 Si confronta il valore di F calcolato con il valore tabulato per , v1=n1-1, v2=n2-1 RITORNARE A LUCIDO 14 (“Qualità e trattamento del dato analitico” APAT 2003) Verona, 23 Ottobre 2007 16

Confronto tra risultati – Test t Ho: XMI =XRIF La differenza tra i due valori non è significativa, cioè dovuta solo a fluttuazioni statistiche Se l’ipotesi nulla verrà scartata, si dovrà accettare l’ipotesi alternativa, secondo la quale XMI XRIF Si definisce il livello di significatività  (di solito del 5% o dell’1%) Si calcola la grandezza t. Verona, 23 Ottobre 2007 17

Confronto tra risultati – Test t I CASO: la differenza tra le varianze non è statisticamente significativa (S12 = S22) v = n1 + n2 – 2 p = 1 - a/2 (tabella unilaterale) p = 1 - a (tabella bilaterale) n1, n2 = numero di determinazioni x1,x2 = valori medi Sd = deviazione standard pesata S12, S22 = varianze (“Qualità e trattamento del dato analitico” APAT 2003) Verona, 23 Ottobre 2007 18

Confronto tra risultati – Test t II CASO: la differenza tra le varianze è statisticamente significativa (S12  S22) p = 1 - a/2 (tabella unilaterale) p = 1 - a (tabella bilaterale)  n1, n2 = numero di determinazioni x1,x2 = valori medi S12, S22 = varianze v = numero di gradi di libertà (“Qualità e trattamento del dato analitico” APAT 2003) Verona, 23 Ottobre 2007 19

Dichiarazione di validazione Il processo di validazione si conclude con una dichiarazione di validazione che deve contenere in sintesi i seguenti dati: Selettività Limite di rilevabilità Limite di quantificazione Intervallo di lavoro ed intervallo di linearità Precisione (ripetibilità e riproducibilità) Accuratezza Sensibilità Robustezza Recupero Incertezza Verona, 23 Ottobre 2007 20

Conclusione La validazione è sempre un bilancio fra costi, rischi di errore e possibilità tecniche. Vi sono molti casi in cui i valori dei parametri di validazione possono essere forniti unicamente in modo semplificato a causa di scarsità di informazioni. Verona, 23 Ottobre 2007 21