III Convegno SCAN 31 maggio 2005 IDENTIFICAZIONE DI AUTOANTIGENI ENDOTELIALI IN LES CON MANIFESTAZIONI PSICHIATRICHE Elena Ortona III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Autoimmunità L'autoriconoscimento è un fenomeno fisiologico essenziale nell'omeostasi dell'immunita' e nel controllo delle risposte immunitarie. La risposta autoimmunitaria rappresenta un fenomeno secondario e privo di un rilevante significato patogenetico; es. transitoria comparsa in circolo di autoanticorpi in soggetti con infarto del miocardio, di autoanticorpi antimuscolo liscio nella gran parte delle virosi acute; di anticorpi antinucleari nell'epatite indotta da virus di tipo A o B, e di anticorpi anticute negli ustionati gravi. La denominazione " malattia autoimmune ", riguarda solo quei casi in cui le alterazioni strutturali e funzionali sono causate da risposte immunitarie rivolte verso costituenti propri dell'organismo. Il prototipo delle malattie autoimmuni cosi' definite viene considerato il " Lupus Eritematoso Sistemico " (LES). III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Autoanticorpi associati con il LES Autoanticorpo Frequenza(%) Specificità diagnostica ANA 95-98 Di screening ma non specifici Anti-dsDNA 50-60 Alta. A titolo elevato nel LES con coinvolgimento renale e cerebrale Anti-RNP 5-10 Abbastanza alta. Nel LES con F.Raynaud ed interessamento polmonare Anti-Sm 15-20 Alta. Nel LES con coinvolgimento renale e cerebrale Anti-SSA/Ro Circa 30 Bassa. Fotosensibilità, LES cutaneo sub-acuto, Lupus neonatale, Lupus associato a deficit di complemento Anti-SSB/La Circa 10 Bassa.Nel Lupus neonatale in associazione con anti-SSA/Ro o nel LES con “Sicca Sindrome” Anti-Ku Alta Anti-PCNA 3-4 III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Lupus eritematoso sistemico Il LES è una malattia cronica autoimmune sistemica con un ampio spettro di manifestazioni cliniche ARTRITE GLOMERULONEFRITE MANIFESTAZIONI CUTANEE PLEURITE E PERICARDITE ALTERAZIONI EMATICHE MANIFESTAZIONI NEUROPSICHIATRICHE III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Manifestazioni psichiatriche nel LES Reazioni psicologiche alla malattia cronica Aspetti legati all'effetto collaterale di alcuni farmaci assunti (cortisone in particolare) Eventuali aspetti riguardanti la personalita' premorbosa del paziente Manifestazioni neuropsichiatriche dovute a danni organici propri del Lupus Eritematoso Sistemico (NEURO-LES) III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Sindromi neuropsichiatriche definite dal ACR Research Committee   Acute confusional state Guillain-Barrè syndrome Anxiety disorder Aseptic meningitis Cerebrovascular disease Cognitive dysfunction Demyelinating syndrome Headache Mononeuropathy Transverse myelopathy Mood disorder Movement disorder Myasthenia gravis Autonomic neuropathy Plexopathy Polyneuropathy Psychosis Seizure disorders III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Fattori patogenetici primari associati a LES con manifestazioni neuropsichiatriche   Alterazioni vascolari Vasculopatie non infiammatorie Vasculiti Trombosi Citochine Interleuchine 2, 6, 8 e 10 Interferon  Autoanticorpi Anticorpi anti-neuroni Anticorpi anti-proteina P ribosomale Anticorpi anti-fosfolipidi AECA III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Presenza di autoanticorpi nel CSF DUE IPOTESI ►La sintesi degli autoanticorpi avviene in periferia e il passaggio nel CSF avviene a causa del danneggiamento della barriera emato-encefalica, per vasculopatie e microinfarti. ►La sintesi degli autoanticorpi avviene direttamente nel sistema nervoso. Le cellule B o le plasmacellule possono attraversare la barriera emato-encefalica a livello parenchimatico e secernere anticorpi a livello intratecale (aumento dell’espressione di molecole di adesione). III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Meccanismi patogenetici degli autoanticorpi coinvolti nelle manifestazioni neuropsichiatriche Anticorpi anti-cellule endoteliali aumentano la permeabilità del microcircolo Autoanticorpi cross-reattivi con recettori neuronali III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Cross-reazioni tra anticorpi anti-DNA e il recettore NMDA Recentemente è stato dimostrato che: un subset di anticorpi anti-DNA in pazienti con NPSLE cross-reagiscono con recettori NMDA Tali anticorpi possono causare morte neuronale attraverso un meccanismo eccitotossico Gli anticorpi sono stati trovati anche nel CSF di pazienti con NPSLE. Nature Medicine 7:1189 2001 III Convegno SCAN 31 maggio 2005

AECA e manifestazioni psichiatriche   No psychiatric group N=34 Normal Donors N=66 p<0.0001 *P<10-4 Conti et al. Arthritis Res Ther 2004 III Convegno SCAN 31 maggio 2005

RUOLO DEGLI ANTICORPI ANTI-CELLULE ENDOTELIALI (AECA) GLI AECA SONO PRESENTI NEL SIERO DEI PAZIENTI CON PATOLOGIE AUTOIMMUNI CARATTERIZZATE DA UN DANNO VASCOLARE EVIDENZE CLINICHE DIMOSTRANO CHE GLI AECA SONO COINVOLTI NELLA PATOGENESI DEL LES E SONO CORRELATI CON L’ATTIVITÀ DELLA MALATTIA LE MOLECOLE BERSAGLIO DEGLI AECA SONO PER LA MAGGIOR PARTE SCONOSCIUTE IN MODELLI SPERIMENTALI GLI AECA SONO IN GRADO DI ATTIVARE E DANNEGGIARE LE CELLULE ENDOTELIALI III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Gli AECA causano attivazione, lisi e apoptosi delle cellule endoteliali III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Identificazione delle molecole bersaglio degli AECA Comprensione dei meccanismi patogenetici Utilizzo come marcatori diagnostici e/o prognostici di manifestazioni psichiatriche III Convegno SCAN 31 maggio 2005

OBIETTIVI DEL PROGETTO DI RICERCA Identificazione di nuovi autoantigeni endoteliali mediante screening di librerie di espressione ed analisi proteomiche. Valutazione del ruolo patogenetico degli autoanticorpi specifici su linee cellulari e su modelli murini. Caratterizzazione della risposta immunologica specifica e valutazione del loro uso nella diagnosi e nel monitoraggio. III Convegno SCAN 31 maggio 2005

SCREENING DELLA LIBRERIA DI ESPRESSIONE HUAEC III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Espressione e purificazione della proteina ricombinante La sequenza nucleotidica del cDNA clonato viene sequenziato con sequenziatore automatico.ABI Prism 310 Collection (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Le sequenze vengono poi confrontate con le banche dati mediante Fasta e Blast Il cDNA viene clonato nel vettore di espressione QIA express vector, pQE30. La proteina di fusione è espressa in Escherichia coli SG130009 e purificata per cromatografia di affinità con una resina di NI-NTA specifica per la coda di 6 istidine III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005 NEDD5 C-T III Convegno SCAN 31 maggio 2005

NEDD5 APPARTIENE ALLA FAMIGLIA DELLE SEPTINE NEDD5 È UNA PROTEINA DEL CITOSCHELETRO ED APPARTIENE ALLA FAMIGLIA DELLE SEPTINE, UNA FAMIGLIA DI PROTEINE MOLTO CONSERVATE E COINVOLTE IN DIVERSI PROCESSI CELLULARI NEDD5 È UNA PROTEINA DI 361 aa ED UN PESO MOLECOLARE DI 41,5 kDa. ESSA È CARATTERIZZATA DA TRE DOMINI FUNZIONALI: NEDD5 È ESPRESSA IN MODO PREDOMINANTE NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE DOVE E’ COINVOLTA NELLA REGOLAZIONE DELLA SECREZIONE. NEDD5 CONTRIBUISCE INOLTRE ALLA FORMAZIONE DELLE LESIONI NEUROFIBRILLARI NELLA MALATTIA DI ALZHEIMER. III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Caratterizzazione immunochimica di Nedd5 III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Localizzazione di NEDD5 in cellule HEP-2 e in cellule endoteliali III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Apoptosi e Autoimmunità Come fa una proteina intracellulare a diventare autoantigenica? Apoptosi e Autoimmunità Le malattie autoimmuni come il lupus sono caratterizzate da un difetto della regolazione dell’apoptosi e dall’accumulo di cellule apoptotiche. Le modificazioni di proteine intracellulari durante l’apoptosi e la loro redistribuzione sulla superficie delle cellule apoptotiche portano all’induzione della risposta autoimmune. III Convegno SCAN 31 maggio 2005

DISTRIBUZIONE DI NEDD5 IN CELLULE ENDOTELIALI DURANTE L’APOPTOSI III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005 IgG anti-Nedd5 in pazienti con LES divisi in base alla presenza di manifestazioni psichiatriche . * P= 0.04 ,# P= 0.034,° P= 0.003; ^ P=0.046; § P=0.007. III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Conclusioni Nedd5 è un nuovo autoantigene nel LES. L’espressione di Nedd5 sulla superficie di cellule endoteliali in apoptosi giustifica la reattività autoimmune di questa proteina intracellulare. IgG anti-Nedd5 sono associate alla presenza di manifestazioni psichiatriche in pazienti con LES e possono essere un marcatore immunologico di tali manifestazioni. Ulteriori studi chiariranno se questi autoanticorpi siano patogenetici. III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Prospettive future IgG anti-Nedd5 III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Immunoblotting di proteine di membrana di cellule endoteliali rivelate con IgG presenti nel liquor di 2 pazienti con lupus psichiatrico e di 2 soggetti senza malattie autoimmuni kDa 194 116 95 51 37 29 20 6 III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Maurizio Sorice Dipartimento Medicina Sperimentale e Patologia, Università “La Sapienza”, Roma. Fabrizio Conti Guido Valesini Dipartimento di Clinica e Terapia Medica Applicata, Cattedra di Reumatologia, Università “La Sapienza”, Roma. Ada Francia Simona Pontecorvo III Cattedra Neurologica, Università “La Sapienza”, Roma. Paola Margutti Federica Delunardo Ettore Piro Rachele Riganò Elisabetta Profumo Brigitta Buttari Alessandra Siracusano III Convegno SCAN 31 maggio 2005