Rago Giuseppe F., Bartiromo Federica, Giarletta Mario Resolution of Inflammation: Prostaglandin E2 Dissociates Nuclear Trafficking of Individual NF-kB Subunits (p65, p50) in Stimulated Rheumatoid Synovial Fibroblasts Paul F. Gomez, Michael H. Pillinger, Mukundan Attur, Nada Marjanovic, Mander Dave, Jean Park, Clifton O. Bingham III, Hayf Al-Mussawir, and Steven B. Abramson Department of Rheumatology, Hospital for Joint Diseases and Department of Medicine, New York University School of Medicine, New York, NY 10003; Department of Medicine, New York Harbor Veterans Affairs Healthcare System New York Campus, New York, NY 10010 The Journal of Immunology Rago Giuseppe F., Bartiromo Federica, Giarletta Mario

L’infiammazione Per infiammazione o flogosi si intende un meccanismo di difesa non specifico innato, che costituisce una risposta protettiva, seguente all’azione dannosa di agenti fisici, chimici, biologici il cui obiettivo finale è l’eliminazione della causa iniziale di danno cellulare o tissutale.

L’infiammazione consiste in una sequenza dinamica di fenomeni che si manifestano con una intensa reazione vascolare. L’infiammazione serve a distruggere diluire e confinare l’agente lesivo, ma allo stesso tempo mette in moto dei meccanismi che favoriscono la riparazione o la sostituzione di tessuto danneggiato. Clinicamente i segni cardine dell’infiammazione sono: arrossamento, tumefazione, calore, dolore, alterazione funzionale.

L’infiammazione acuta L'infiammazione acuta è una risposta immediata e precoce a uno stimolo lesivo. È una reazione vascolare e cellulare al danno tissutale. Si caratterizza per: 1.modificazioni vascolari; 2.passaggio dei leucociti dal letto capillare al tessuto leso; 3.migrazione dei leucociti all'interno del tessuto soggetto al processo flogistico.

L’ifiammazione cronica L'infiammazione cronica è un processo flogistico di lunga durata in cui coesistono l'infiammazione attiva, la distruzione tissutale e i tentativi di riparazione.

I mediatori flogistici Ammine vasoattive (mast cells, piastrine) Istamina, serotonina Vasodilatazione, permeabilità Complemento, chinine, fattori della coagulazione Permeabilità, chemiotassi, opsonizzazione Metaboliti dell’acido arachidonico Prostaglandine e trombossano (cicloossigenasi) Leucotrieni (lipossigenasi) Vasodilatazione, permeabilità, chemiotassi, dolore Citochine (linfociti e macrofagi attivati) Modulano la funzionalità di altre cellule + importanti= TNFalfa, IL (attivazione endoteliale), INFgamma (attivazione macrofagica)

Gli studiosi hanno fatto emergere che IL-1 e TNF partecipano alla regolazione di malattie inclusa l’artrite reumatoide. Vengono prodotte principalmente dai macrofagi attivati La secrezione di TNF e IL-1 può essere stimolata da endotossine e atri prodotti microbici, immunocomplessi, lesioni fisiche Sia IL-1 che TNF stimolano i fibroblasti sinoviali a secernere mediatori come PGE2, metallo-proteinasi, fattori di crescita.

Nf-kb e infiammazione NF-κB controls many genes involved in inflammation, it is not surprising that NF-κB is found to be chronically active in many inflammatory diseases, such as inflammatory bowel disease, arthritis, sepsis,gastritis, asthma, among others. Many natural products (including anti-oxidants) that have been promoted to have anti-cancer and anti-inflammatory activity have also been shown to inhibit NF-κB. NF-κB was first discovered in the lab of Nobel Prize laureate David Baltimore via its interaction with an 11-base pair sequence in the immunoglobulin light-chain enhancer in B cells.

Ruolo di NF-kB nella vita della cellula Trascrizione di geni Enzimi di risposta allo stress Molecole direttamente coinvolte nel ciclo cellulare Molecole di adesione Proteine anti-apoptotiche Bcl-2, cIaP1, cIaP2 Citochine pro-infiammatorie

Nf-kb: fattori trascrizonali implicati nell’infiammazione Nf-kb è una famiglia di fattori trascrizionali dimerici formati da etero ed omodimeri di proteine della famiglia REL. Ci sono 5 proteine Rel tra queste si individuano due sottogruppi: Espressi come precursori delle proteine p105 e p100. Non hanno dominio di trans-attivazione. P50 P52 Contengono domini di trans-attivazione RelA(p65) RelB cRel  trascrizione  trascrizione

Schematic diagram of NF-κB protein structure Schematic diagram of NF-κB protein structure. There are two structural classes of NF-κB proteins: class I (top) and class II (bottom). Both classes of proteins contain a N-terminal DNA-binding domain (DBD), which also serves as a dimerization interface to other NF-κB transcription factors and in addition binds to the inhibitory IκBα protein. The C-terminus of class I proteins contains a number of ankyrin repeats and has transrepression activity. In contrast, the C-terminus of class II proteins has a transactivation function.

Mechanism of NF-κB action Mechanism of NF-κB action. In this figure, the NF-κB heterodimer between Rel and p50 proteins is used as an example. While in an inactivated state, NF-κB is located in the cytosol complexed with the inhibitory protein IκBα. Through the intermediacy of integral membrane receptors, a variety of extracellular signals can activate the enzyme IκB kinase (IKK). IKK, in turn, phosphorylates the IκBα protein, which results in ubiquitination, dissociation of IκBα from NF-κB, and eventual degradation of IκBα by the proteosome. The activated NF-κB is then translocated into the nucleus where it binds to specific sequences of DNA called response elements (RE). The DNA/NF-κB complex then recruits other proteins such as coactivators and RNA polymerase, which transcribe downstream DNA into mRNA, which, in turn, is translated into protein, which results in a change of cell function.

NF-kb I dimeri di nf-kb si legano ai promotori dell’NO sintasi e a quelli della cicloossigenasi2 inducendone l’espressione. Tra le PG sintetizzate da COX2, PGE2 è forse la meglio studiata. PGE2 media la vasodilatazione, la permeabilità vascolare e il dolore, può anche avere effetti antinfiammatori

Le prostaglandine si formano velocemente, esercitano i loro effetti localmente

La cicloossigenasi compie il primo passo nella sintesi delle prostaglandine a partire da un comune acido grasso, l'acido arachidonico. Come è illustrato nel riquadro qui a destra, la cicloossigenasi aggiunge due molecole di ossigeno all'acido arachidonico, cominciando una serie di reazioni che produrranno, alla fine, una varietà di prostaglandine diverse. L'aspirina impedisce il legame dell'acido arachidonico nel sito attivo della cicloossigenasi COX-1 e COX-2 In realtà noi possediamo due cicloossigenasi diverse (chiamate COX-1 e COX-2) e le utilizziamo per scopi diversi. La COX-1 è presente in quasi tutte le nostre cellule, sintetizza le prostaglandine usate in tutto il corpo per mantenere una corretta fisiologia. Il secondo enzima, la COX-2, viene prodotto solo occasionalmente e solo nelle cellule coinvolte nella risposta infiammatoria o immunitaria. Causa dolore e gonfiore in risposta ad un danno fisico o ad un infezione, aumenta la permeabilità delle pareti dei vasi sanguigni e fa giungere le cellule del sistema immunitario al tessuto danneggiato.

Cicloossigenasi Un Enzima Complesso Questo enzima, in realtà, ha due siti attivi diversi, chiamati complessivamente prostaglandina sintasi. Su un lato, c'è il sito attivo di cicloossigenasi. Sul lato opposto, c'è il sito di perossidasi completamente separato dall'altro, che è necessario per attivare i gruppi eme che partecipano alla reazione di cicloossigenasi. Il complesso enzimatico in realtà è un dimero composto di due subunità identiche, così ci sono due siti attivi di cicloossigenasi e due siti attivi di perossidasi molto vicini gli uni agli altri. Inoltre, ogni subunità ha una piccola protuberanza ricca di catene idrocarburiche apolari, diretta verso il basso in questa figura. Queste protuberanze ancorano il complesso alla membrana del reticolo endoplasmatico, mostrata in azzurro sul fondo della figura. Il sito attivo di cicloossigenasi è nascosto in profondità all'interno della proteina, ed è raggiungibile attraverso un tunnel che sbuca al centro della protuberanza. Il tunnel si comporta come un imbuto, guidando l'acido arachidonico fuori dalla membrana e all'interno dell'enzima dove viene fatto reagire.

Contrariamente alla maggior parte degli ormoni, che sono prodotti in ghiandole specializzate e poi trasportati in tutto il corpo dal sangue, le prostaglandine vengono sintetizzate dalle cellule e poi agiscono solo nell'area circostante prima di venire demolite. Le prostaglandine sono eicosanoidi che appartengono alla famiglia degli autacoidi, sono cioè delle molecole che vengono liberate dalla cellula nell’ambiente extracellulare. Gli eicosanoidi sono sintetizzati in seguito all’interazione di stimoli di diversa natura con la membrana cellulare e diffondono immediatamente nell’ambiente extracellulare Gli eicosanoidi si formano a partire dall’ acido arachidonico

dal 1935 le “prostaglandine” Dal punto di vista chimico, le prostaglandine sono acidi grassi, solubili nella componente lipidica del corpo umano. Benché l'identificazione delle prostaglandine da parte del fisiologo svedese Ulf von Euler risalga al 1935, le ricerche su composizione, struttura, funzioni e applicazioni cliniche di queste sostanze ebbero inizio solo alla fine degli anni Sessanta. Nel 1971 il farmacologo britannico John Robert Vane dimostrò che molti effetti clinici dell'Aspirina® sono collegati alla capacità di questo farmaco di inibire la sintesi di determinate prostaglandine.

Note cliniche Alcune prostaglandine provocano la costrizione dei vasi sanguigni. Questo effetto viene sfruttato in ostetricia, dal momento che la costrizione dei vasi sanguigni che irrorano l'utero provoca una stimolazione delle contrazioni di quest'organo; preparati farmacologici a base di prostaglandine possono essere somministrati alle donne incinte per indurre il parto o l'aborto terapeutico. A causa dell'effetto esercitato sui vasi dell'utero, le prostaglandine prodotte dall'organismo sono responsabili della dismenorrea, cioè del dolore e dei crampi accusati da molte donne nei primi giorni del ciclo mestruale. In generale le loro funzioni vanno dalla coagulazione del sangue, al metabolismo dell’osso, allo sviluppo del sistema nervoso, alla funzione renale, al tono dei vasi sanguigni, alle rispote immuni

PGE2 Systematic (IUPAC) name Le prostaglandine, simili ad altri eicosanoidi,   sono costituite da 20 atomi di carbonio ma questo sottogruppo è caratterizzato da una struttura ad anello con  carbonio in  posizione 5.  Furono scoperte nel 1930 nelle secrezioni prodotte  dalla ghiandola prostatica, da cui deriva il loro nome. Oggi si sa che le prostaglandine sono praticamente varietà di reazioni biochimiche. Ogni prostaglandina viene indicata con una lettera maiuscola ed un numero minuscolo, come la prostaglandina E2  (PGE2). La lettera indica la sostituzione nell’anello, del carbonio in posizione 5, con una molecola di ossigeno o di idrossido. Il numero indica i doppi legami presenti nella catena molecolare laterale. Systematic (IUPAC) name 7-[3-hydroxy-2-(3-hydroxyoct-1-enyl)- 5-oxo-cyclopentyl] hept-5-enoic acid

Acido 5,8,11,14- eicosantetraenoico La cicloossigenasi trasforma l’AA nella Prostaglandina endoperossido PGG2 a sua volta convertita in PGH2, dal quale si otteranno i prodotti finali.

The naturally occurring prostaglandin E2 (PGE2) is known in medicine as dinoprostone. Like other prostaglandins, dinoprostone can be used as an abortifacient. It works by binding and activating the prostaglandin E2 receptor. It was discovered by Bunting, Gryglewski, Moncada and Vane in 1976.

Figure . The relationship between EP receptor (EP) activation by PGE2 and other signal transduction pathways. Signaling through EP2 leads to GSK-3 phosphorylation via a protein kinase A–dependent mechanism (A).

Gli studi di Zurier et al Gli studi di Zurier et al. Indicano che la PGE2 può ridurre l’infiammazione in modelli animali che presentano artrite reumatoide. Side view of the crystallographic structure of a homodimer of the RELA protein (green and magenta) bound to DNA (brown).

Le PGE2 sono mediatori dell’infiammazione, ma possono anche mediare effetti anti-infiammatori

PGE2 Secrezione delle MMP-1 ATTRAVERSO EFFETTI SU ERK Sintesi del superossido PGE2 Secrezione delle MMP-1 ATTRAVERSO EFFETTI SU ERK

PGE2 NF-kB Esiste una relazione? Gli autori dell’articolo, partendo da queste considerazioni e usando RA SF (rheumatoid arthritis synovial fibroblasts), sono andati alla ricerca della relazione tra PGE2 ed NF-kB. PGE2 NF-kB Esiste una relazione?

Cos’è la RA? Processo infiammatorio a carico del tessuto connettivo - tessuto di sostegno presente in tutti gli organi ed in modo particolare a livello articolare - conseguenza di una reazione di tipo auto-immunitario. Dunque i fibroblasti - i maggiori produttori della matrice extracellulare – sono interessati dal processo infiammatorio.

Le prostaglandine E2 sono in grado di regolare la localizzazione nucleare di p65 e p50, subunità attivate di NF-kB?

Premessa L’IL1-B e il TNFa stimolano la traslocazione nucleare di p65 e p50 con conseguente attivazione di NF-kB

NON ATTIVAZIONE DI NF-kB In seguito a somministrazione di PGE2, si è osservato: Traslocazione nucleare di p50 Accumulo citosolico di p65 NON ATTIVAZIONE DI NF-kB

Quindi, PGE2 dissocia il traffico nucleare delle singole subunità di NF-kB, giocando UN EFFETTO ANTI-INFIAMMATORIO

Quali sono i meccanismi con cui agisce PGE2?

1 PGE2 blocca l’attivazione di ERK stimolata da IL-1B e da TNFa Quindi, PGE2 agisce con un meccanismo dipendente da ERK

Quindi, PGE2 agisce anche con un meccanismo Inoltre, PGE2 stimola l’espressione di IKBa tramite up-regulation Quindi, PGE2 agisce anche con un meccanismo indipendente da ERK

Feedback Loop

Citochine NF-kB COX-2 PGE2 ERK IKBa

Results

PGE2 inibisce la traslocazione nucleare di p65 ma intensifica quella di p50 ERK promuove la traslocazione nucleare di p65 ma inibisce quella di p50 PGE2 regola l’attivazione di NF-kB attraverso meccanismi dipendenti e non da ERK L’attivazione di ERK e l’espressione di COX2

in assenza di stimolazione bassi livelli di p50 nucleare e livelli pressochè nulli di p65 nucleare.

Il trattamento con IL-1β o con TNFα separatamente o contemporaneamente ha lo stesso effetto

La traslocazione nucleare di p50 e p65 dopo 6 ore è aumentata considerevolmente

Dato che PGE2 ha effetti anti-infiammatori nei RA SF, come PGE2 regola la localizzazione di p50 e p65 nei RA SF umani? Considerando che: IL-1B e TNFa stimolano la continua traslocazione nel nucleo di p65 e p50 durante le 6 ore I livelli citoplasmatici di p65 e p50 si riducono dopo 1 ora di stimolazione per la traslocazione di un pool citosolico, ma erano recuperati dopo 6 ore Prima della stimolazione, i RA SF sono stati trattati con cicloesimide e questo inibiva il riaccumulo di p65 e p50 nel citosol

… e questo indica che IL-1B e TNFa stimolano la sintesi de novo di p65 e p50 che sono successivamente localizzate nel citosol…

Diamo uno sguardo a p50

Analizziamo le quantità di p65 e p50

Inibisce la traslocazione Promuove la traslocazione PGE2 Inibisce la traslocazione Promuove la traslocazione nucleare di p65 nucleare di p50 PGE2 agisce attraverso effetti separati sulle due proteine Ma come possono questi effetti avere consguenze sulla trascrizione?

Quali sono gli effetti dell’inibizione di COX? Ma cosa accade a monte della secrezione di PGE2? Quali sono gli effetti dell’inibizione di COX?

PGE2 inibisce la traslocazione nucleare di p65 ma intensifica quella di p50 ERK promuove la traslocazione nucleare di p65 ma inibisce quella di p50 PGE2 regola l’attivazione di NF-kB attraverso meccanismi dipendenti e non da ERK L’attivazione di ERK e l’espressione di COX2

PGE2 inibisce la traslocazione nucleare di p65 ma intensifica quella di p50 ERK promuove la traslocazione nucleare di p65 ma inibisce quella di p50 PGE2 regola l’attivazione di NF-kB attraverso meccanismi dipendenti e non da ERK L’attivazione di ERK e l’espressione di COX2

Come ERK regola la traslocazione nucleare di p65 e di p50? Regola entrambe le proteine allo stesso modo o in maniera separata e diversificata?

ERK promuove la traslocazione nucleare di p65 ma non di p50

Come essere sicuri che la via di trasduzione di ERK sia legata alla traslocazione di p65? GFP caMEK DsRed p65

MEK ERK P65 nel nucleo

PGE2 inibisce la traslocazione nucleare di p65 ma intensifica quella di p50 ERK promuove la traslocazione nucleare di p65 ma inibisce quella di p50 PGE2 regola l’attivazione di NF-kB attraverso meccanismi dipendenti e non da ERK L’attivazione di ERK e l’espressione di COX2

Dato che PGE2 e PD98059 inibiscono la traslocazione nucleare di p65 e intensificano quella di p50 PGE2 potrebbe regolare NF-kB attraverso inibizione di ERK?

Dato che l’evento iniziale nell’attivazione di NF-kB è la fosforilazione, l’ubiquitinazione e la degradazione di IKBa PGE2 ed ERK possono agire sulla localizzazione di p65 e p50 attraverso effetti su IKBa?

I livelli di IKBa non sono regolati da ERK

PGE2 inibisce la traslocazione nucleare di p65 ma intensifica quella di p50 ERK promuove la traslocazione nucleare di p65 ma inibisce quella di p50 PGE2 regola l’attivazione di NF-kB attraverso meccanismi dipendenti e non da ERK L’attivazione di ERK e l’espressione di COX2

PGE2 ed ERK regolano l’espressione di COX2 nei RA SF?

PGE2 ERK pathway COX2

Possono le PGE2 diminuire i livelli di iNOS nei macrofagi attivati? FEBS Lett. 1998 Nov 27;440(1-2):76-80. Prostaglandins prevent inducible nitric oxide synthase protein expression by inhibiting nuclear factor-kappaB activation in J774 macrophages. D'Acquisto F, Sautebin L, Iuvone T, Di Rosa M, Carnuccio R. Department of Experimental Pharmacology, University of Naples Federico II, Italy.

LPS iNOS PGE2 iNOS PGE2

LPS PGE2 NF-kB iNOS

Quali sono le basi molecolari PGE2 ed ERK Quali sono le basi molecolari di questo meccanismo?

Premessa

NF-kB

Che cosa avviene quando le PGE2 legano il loro recettore EP-2?

PKA

PGE2 EP2 cAMP PKA SHP-1 JAK

Un’attivazione sostenuta di NF-kB è stata osservata in lesioni aterosclerotiche ed in cellule muscolari lisce dei vasi arteriosi.

Colesterolo, alpha-trioli COX-2 PGE2 Toxicol Lett. 2009 Oct 28;190(2):172-8. Epub 2009 Jul 16. Cholesterol-3-beta, 5-alpha, 6-beta-triol induced PI(3)K-Akt-eNOS-dependent cyclooxygenase-2 expression in endothelial cells. Liao PL, Cheng YW, Li CH, Lo YL, Kang JJ. Institute of Toxicology, College of Medicine, National Taiwan University, Jen-Ai Road, Section 1, Taipei 100, Taiwan, ROC. Colesterolo, alpha-trioli COX-2 PGE2 e-NOS NO

L’ effetto e’ probabilmente dovuto a: aumento del cGMP → attivazione della PKG → fosforilazione della catene leggere della miosina → rilassamento della muscolatura liscia dei vasi (vasodilatazione)

IKBa

Coniugati piastrine - leucociti Platelets. 2008 Dec;19(8):605-13. DG-041 inhibits the EP3 prostanoid receptor--a new target for inhibition of platelet function in atherothrombotic disease. Heptinstall S, Espinosa DI, Manolopoulos P, Glenn JR, White AE, Johnson A, Dovlatova N, Fox SC, May JA, Hermann D, Magnusson O, Stefansson K, Hartman D, Gurney M. Department of Cardiovascular Medicine, University of Nottingham, Nottingham, UK. s.heptinstall@nottingham.ac.uk PGE2 EP-3 P-selectin Coniugati piastrine - leucociti Effetti pro - aggregatori

si associa con Leucociti e VSMC Thromb Haemost. 2007 Aug;98(2):287-95. Regulation of hyaluronan synthesis by vasodilatory prostaglandins. Implications for atherosclerosis. Fischer JW, Schrör K. Institut für Pharmakologie und Klinische Pharmakologie, Universitätsklinikum Düsseldorf, Düsseldorf, Germany. jens.fischer@uni-duesseldorf.de PGE-2 EP-2 HAS 1 e 2 Acido Ialuronico si associa con Leucociti e VSMC

…Grazie per l’attenzione…