PCR Restriction Analysis
Il principio hsp65: gene altamente conservato Digestione con un enzima di restrizione specifico per una sequenza nucleotidica non molto frequente Determinazione del pattern dei frammenti di restrizione Confronto con pattern di restrizione appartenenti a specie note
Il metodo Amplificazione di una porzione di 439 bp all’interno del hsp65 Digestione dell’amplificato usando (separatamente) 2 diversi enzimi di restrizione Separazione elettroforetica dei prodotti di digestione di ciascun enzima Determinazione, per confronto con pesi molecolari noti, delle dimensioni dei frammenti (quelli inferiori a 40 bp vengono ignorati) Uso di un algoritmo per raggiungere l’identificazione di specie
I frammenti di restrizione BstEII nessuna digestione (440 bp) produzione di 2-3 frammenti (320-80 bp) HaeIII produzione di 2-5 frammenti (265-40 bp)
BstEII
HaeIII
hsp65 PRA: l’algoritmo Differenziazione delle specie, all’interno del pattern di restrizione prodotto da BstEII, in base al pattern prodotto da HaeIII BstEII HaeIII 200/60/50 bp M. chelonae 150/105 bp M. haemophilum 320 bp 130 bp 120 bp 185/130 bp M. terrae 145/130/50 bp M. simiae 130/115/60 bp M. gordonae 130/95/75/60 bp M. kansasii . . . . . .
Sviluppi Determinazione delle dimensioni esatte dei frammenti, mediante sequenziamento Presenza di un sito Internet (PRA-Site) contenente tutti i pattern di restrizione delle specie batteriche note
Conclusioni Di facile esecuzione ed economico Svariate specie sono caratterizzate da più di un pattern (fino a 9) Alcune specie hanno pattern indistinguibili