FACOLTA’ DI MEDICINA E CHIRURGIA I Retrovirus FACOLTA’ DI MEDICINA E CHIRURGIA A.C. 2009/2010 Claudia Maugeri Gianmarco Motta Grazia Paladino Eliana Pellegrino Prof.ssa Cinzia Di Pietro

Appartengono alla famiglia dei virus Appartengono alla famiglia dei virus. Sono quindi anch’essi parassiti endocellulari obbligati.

Si tratta di aggregati molecolari privi di organelli che ne permettano la replicazione. Dunque se i retrovirus non penetrano in una cellula non riescono a duplicarsi.

Esternamente presentano un un involucro fosfolipidico detto capside o “envelope”. All’interno è contenuto il genoma costituito da due molecole di Rna.

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Il genoma virale contiene almeno tre geni fondamentali: GAG (group specific antigen), che codifica per le proteine strutturali. POL (polymerase), che codifica per l’ enzima Trascrittasi inversa. ENV (envelope), che codifica per le proteine di membrana.

Nel genoma virale sono state identificate numerose sequenze che agiscono in cis durante la replicazione virale. Tra queste sequenze vi sono i due LTR (“long terminal repeat”) situate al 5’ e al 3’ del genoma del retrovirus, che contengono regioni coinvolte nella trascrizione inversa, nell’integrazione e nella regolazione dell’espressione del genoma virale. Tra le altre sequenze disperse all’interno del genoma si trova anche il segnale di impacchettamento (“packaging signal”) che permette il trasferimento del genoma virale all’interno del virione.

Ruolo della trascrittasi inversa nei retrovirus Attività della trascrittasi inversa La trascrittasi inversa è un enzima il cui ruolo è quello di trascrivere l'informazione genica da molecola di RNA a molecola di DNA. Sintesi di cDNA L'enzima della trascrittasi inversa, per prima cosa, inizia a trascrivere a partire dal RNA una molecola di DNA complementare nonsense o cDNA. Il punto di avvio è codificato all'interno dell'RNA e prende il nome di promotore costituito da una sequenza di poli-T. L'enzima non possiede l'attività di correzione delle bozze e, pertanto, nel filamento di cDNA si introducono degli errori che determinano la variabilità del virus e la conseguente crisi del sistema immunitario che, ogni volta, si trova di fronte un virus apparentemente sconosciuto.

Sintesi di dscDNA La sintesi del cDNA a doppio filamento (dscDNA) avviene sulla base del cDNA precedentemente sintetizzato. L'enzima della trascrittasi inversa se riconosce un solo filamento di ssRNA lo traduce mentre se riconosce lo stesso filamento legato ad una elica di cDNA lo taglia via. Dopo aver liberato la prima elica del cDNA la polimerasi sintetizza l'elica complementare.

RT-PCR Il metodo è costituito da due passaggi: la sintesi di DNA a singolo filamento,utilizzando come stampo l’m RNA e la trascrittasi inversa la successiva amplificazione di questo con la reazione di PCR. L’enzima trascrittasi inversa utilizza un oligonucleotide complementare (Primer 1) per iniziare la sintesi di DNA utilizzando una molecola di RNA stampo. Il ssDNA è poi utilizzato come stampo per la sintesi di un singolo filamento di DNA mediante l’utilizzo del Primer 2. I Primer 1 e 2 sono poi utilizzati per l’amplificazione con la PCR.

Applicazioni terapeutiche mediante retrovirus Sin dagl’anni ‘90 inizia lo studio sulle possibili applicazioni delle caratteristiche dei retrovirus Trasformando il virus patogeno in virus “helper”

I primi studi avevano l’obiettivo di sfruttare i virus come vettori per veicolare il genoma artificiale all’interno del DNA della cellula ospite. Per modificare il patrimonio genetico di essa correggendone i difetti o conferendole una nuova funzione Terapia a livello embrionale Terapia a livello somatico

Procedimento Creazione in laboratorio del “minigene”(transgene):contenente promotore, enhancer e tratti esonici e intronici Eliminazione del genoma virale Inserimento del “minigene” all’interno del virus “epurato” Inserimento del virus”helper”all’interno della cellula da trattare

Applicazioni mediche Cura di malattie genetiche ereditarie monogeniche Cura dei tumori Cura di malattie virali (AIDS) Cura di malattie non monogeniche (diabete, sclerosi multipla, distrofia muscolare) Patologie neurodegenerative come l’Alzheimer e Parkinson

Attività intracellulare Una volta dentro la cellula bersaglio il transgene viene duplicato dalla trascrittasi inversa(transgene ad RNA) Trascritto direttamente(transgene a DNA) Produzione delle proteine funzionali

Terapia tumorale Il transgene inserito nel genoma delle cellule tumorali ha lo scopo di silenziare i processi anomali. Possedendo una maggiore capacità trascrizionale Agendo attraverso regolazione post-trascrizionale

Tumori del cervello Primi tentativi del 1993 Inserimento di vettori virali nelle cellule infette dove i minigeni possiedono un’attività trascrizionale maggiore rispetto al gene difettoso e tratti nucleotidici che agiscono da silencer

1° Terapia contro l’HIV Transgene codifica per proteine di membrana le quali costituiranno dei nuovi recettori che non legheranno le proteine di membrana del virus Terapia piuttosto fallimentare perché l’HIV è mutageno

2° Terapia contro l’HIV Il transgene produrrà trascritti in grado di “formare”proteine che legandosi al genoma virale bloccano la sua attività infettiva

Complicazioni terapeutiche Il vettore deve essere riconosciuto e non attaccato dal sistema immunitario Le cellule bersaglio nel caso dei tumori dovrebbero essere”infettate”una per una. Nel caso delle malattie geniche è difficile agire in maniera mirata perché ancora oggi non si conoscono tutte le connessioni intra e inter-molecolari(network)