EXPERTEAM PROGETTO BIOTECH 1 Regione Veneto – LINEA DI RICERCA N. 14 Inquinamento virale in acqua e loro sedimenti: l’utilizzo della PCR nelle determinazioni analitiche di adenovirus quale indice di qualità.

commercializzazione kit diagnostici Experteam nasce nel 1996 per opera dei biologi Angelo De Bortoli e Federica Schiavon con una serie di kit innovativi in biologia molecolare per la ricerca di virus, batteri, protozoi e per la ricerca di malattie genetiche e tumori. ATTIVITA’: ricerca produzione commercializzazione kit diagnostici

PRINCIPALI SETTORI DI ATTIVITA' Diagnostica genetica (microdelezioni cromosoma Y in pazienti oligo e azoospermici, X fragile, fattori della coagulazione, emocromatosi) Diagnostica virale (HPV, CMV) Diagnostica batterica e parassitaria (m. tuberculosis e complex, b. burgdorferi, ch. pneumoniae, p. carinii, t. gondii, g. lamblia) Diagnostica oncologica (linfomi B e T, traslocazioni cromosomiche) Determinazione di microorganismi negli alimenti (salmonella e listeria) Diagnostica e monitoraggio ambientale Organizzazione e coordinamento corsi specialistici

SCOPO DEL PROGETTO studio per la successiva produzione e messa in commercio di kit diagnostici basati su metodologie di biologia molecolare per la determinazione di virus, batteri e protozoi nelle acque costiere, lagunari, fluviali e di scarico al fine di determinare: il rischio di contrarre patologie dall’uso ricreativo delle acque analizzate (D.P.R. 155 del 1988: attuazione della direttiva 76/160/CEE relativa alla qualità delle acque di balneazione) gli indici di qualità delle acque sulla base dei microrganismi e virus presenti l’efficienza di sistemi di depurazione un determinato ceppo batterico o virale definendone quindi anche l’origine (traceability).

VIRUS ENTERICI Norwalk Epatite A Enterovirus Rotavirus Reovirus virus escreti tramite le feci, caratterizzati dall’abilità ad infettare principalmente i tessuti del tratto respiratorio e gastrointestinale dell’uomo e dei mammiferi Norwalk Epatite A Enterovirus Rotavirus Reovirus Adenovirus virus Poliovirus Coxsackievirus Echovirus

DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS NELLE ACQUE metodo tradizionale: coltura cellulare nuove biotecnologie: RT-PCR tecnicamente complesso lungo (10-30 gg. 1-3 passaggi BGM) costoso non sufficientemente sensibile tecnicamente semplice rapido poco costoso altamente sensibile e specifico

METODO TRADIZIONALE PRELIEVO CAMPIONE POSITIVO: Presenza di enterovirus CONCENTRAZIONE E DECONTAMINAZIONE TECNICA DELL’ IMMUNO- FLUORESCENZA I PASSAGGIO SU COLTURA CELLULARE CAMPIONE NEGATIVO: Presenza di virus enterici e Assenza di enterovirus EFFETTO CITOPATICO ASSENTE: Probabile assenza di virus enterici Monostrato di cellule BGM (Buffalo Green Monkey). Sono cellule di rene di scimmia verde africana che hanno particolare suscettibilità per i virus enterici. CAMPIONE POSITIVO: Presenza di enterovirus EFFETTO CITOPATICO PRESENTE: Presenza di virus enterici TECNICA DELL’ IMMUNO- FLUORESCENZA II PASSAGGIO SU COLTURA CELLULARE CAMPIONE NEGATIVO: Presenza di virus enterici e Assenza di enterovirus EFFETTO CITOPATICO ASSENTE: Probabile assenza di virus enterici CAMPIONE POSITIVO: Presenza di enterovirus EFFETTO CITOPATICO PRESENTE: Presenza di virus enterici TECNICA DELL’ IMMUNO- FLUORESCENZA CAMPIONE NEGATIVO: Presenza di virus enterici e Assenza di enterovirus III PASSAGGIO SU COLTURA CELLULARE Tale metodo richiede da un minimo di 10 ad un massimo di 30 giorni. EFFETTO CITOPATICO ASSENTE: CAMPIONE NEGATIVO: Assenza di virus enterici e di enterovirus

FASI DI MESSA A PUNTO DEL METODO per la determinazione mediante PCR di enterovirus, adenovirus, HAV Ricerca bibliografica Ottimizzazione della procedura di estrazione di RNA e DNA Ottimizzazione della fase di retrotrascrizione-amplificazione (scelta primers, determinazione t. annealing, etc) Reperimento ed analisi di controlli positivi Campionamento ed analisi di campioni ambientali Confronto tra metodologie PCR e metodi tradizionali

RT-PCR per l’analisi di ENTEROVIRUS in campioni di acque di scarico all’uscita dai depuratori protocollo singolo step protocollo PCR nested 1 2 3 4 5 6 7 8 CN CP 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 CN CP 9 10 11 12 13 14 15 16

TIPIZZAZIONE ADENOVIRUS (sierotipi 40/41) PCR per l’analisi di ADENOVIRUS in campioni di acque di scarico all’uscita dai depuratori protocollo singolo step protocollo PCR nested TIPIZZAZIONE ADENOVIRUS (sierotipi 40/41)

PROTOCOLLO OTTIMIZZATO ENTEROVIRUS ADENOVIRUS prelievo campione concentrazione campione saggio su coltura cellulare (1 passaggio BGM) estrazione RNA virale retrotrascrizione PCR (I° ampl.) PCR nested (II° ampl.) elettroforesi gel agarosio prelievo campione concentrazione campione / estrazione DNA virale PCR (I° ampl.) PCR nested (II° ampl.) elettroforesi gel agarosio

RISULTATI CAMPIONI acqua superficiale ENTEROVIRUS (I° P BGM) EC ENTEROVIRUS (I° P BGM) ADENOVIRUS (TQ) IF PCR PCR 40/41 9721 POS 9552 NEG   9554 1397 1398 1728 2213 2219 2389 2558 0485 /  0321  / acqua scarico 0706 8970 9761 2405 2450 TOT. CAMPIONI 17 TOT. POSITIVI 3 ENTEROVIRUS TOT. POSITIVI 14 ADENOVIRUS

RT-PCR per l’analisi di HAV in campioni di acque di scarico all’uscita dai depuratori RT-PCR per l’analisi di REOVIRUS in campioni di acque di scarico all’uscita dai depuratori protocollo singolo step protocollo PCR nested protocollo singolo step protocollo PCR nested CN CP B CP CN B CP CN 1 2 3 CN

PROTOCOLLO OTTIMIZZATO HAV REOVIRUS prelievo campione concentrazione campione estrazione RNA virale retrotrascrizione PCR (I° ampl.) PCR nested (II° ampl.) elettroforesi gel agarosio prelievo campione concentrazione campione estrazione RNA virale retrotrascrizione PCR (I° ampl.) PCR nested (II° ampl.) elettroforesi gel agarosio

Analisi di 39 campioni di acqua di scarico prelevati all’uscita dei depuratori di 11 differenti siti nel periodo aprile –agosto ’05. CAMPIONI ANALIZZATI POSITIVI ADENOVIRUS ENTEROVIRUS HAV 20 TQ 12 (60%) 1 (5%) 0 (0%) 19 IP 1 (5,3%)* 2 (10,5 %)* TOT. 39 13 (33,3%) 3 (7,7%) *I campioni positivi agli enterovirus sono stati analizzati mediante PCR specifica per determinare se si trattava di poliovirus, coxsackie o echovirus, l’analisi ha escluso la presenza di poliovirus .

CONCLUSIONI maggiore sensibilità materiale genetico di partenza DNA VANTAGGI RISCONTRATI NELLA RICERCA DI ADENOVIRUS RISPETTO ENTEROVIRUS E HAV: maggiore sensibilità materiale genetico di partenza DNA non necessaria la coltura cellulare CONCLUSIONI la ricerca di adenovirus, quali indicatori di inquinamento fecale, è più semplice e sensibile rispetto a quella di enterovirus, mentre la determinazione di HAV sembra non essere significativa dato che nessuno dei campioni analizzati è risultato positivo a tale determinazione.

MESSA A PUNTO DI METODICHE PER PCR QUANTITATIVA

REAL TIME PCR metodica SYBR GREEN Curve di amplificazione di 5 diluizioni (106,105,104,103,102 copie di genoma virale) del DNA plasmidico clonato contenente la sequenza 5’ UTR di Enterovirus

REAL TIME PCR metodica TAQ-MAN Curve di amplificazione di 5 diluizioni (106,105,104,103,102,10 copie di genoma virale) del DNA plasmidico clonato contenente la sequenza 5’ UTR di Enterovirus

Analisi su due campioni d’acqua concentrata già risultati positivi per la presenza di enterovirus con il kit Experteam “Enterovirus kit 1” Si sono determinati: la quantità di carica virale presente mediante real time PCR lo specifico ceppo (poliovirus, coxsackie o echovirus) mediante sequenziamento L’analisi quantitativa effettuata mediante Real Time PCR metodica Sybr Green determinava una presenza di virus nei campioni concentrati 5000 volte pari a 0.2 e 0.3 UFP/ml (Unità Formanti Placca / ml). L’analisi di sequenza ha necessitato la messa a punto di un nuovo protocollo in grado di amplificare regioni variabili tra i diversi ceppi di enterovirus. Le tre regioni analizzate e sequenziate sono state : 5’NTR, VP1-2C, VP1-2.

Sequenza ottenuta dall’amplificato 5’NTR del campione 1 L’analisi in Gene Bank ha determinato Campione 1: Coxsackievirus B1 Campione 2: Pur non giungendo ad una specifica tipizzazione si è potuto escludere che si trattasse di un enterovirus di origine umana già descritto in letteratura.

REAL TIME PCR metodica SYBR GREEN Analisi di campioni Determinazione di adenovirus in campioni già risultati positivi mediante pcr qualitativa. Curve di amplificazione degli standard CT = 27 → [500 copie/ml] CT = 34 → [5 copie/ml]

Discussione Il confronto tra la determinazione mediante PCR qualitativa e Real Time PCR per la determinazione di enterovirus e adenovirus ha dimostrato come la PCR qualitativa risulti più sensibile rispetto alla Real Time. D’altra parte tutti i protocolli qualitativi utilizzati in questa fase erano “nested” mentre i protocolli Real Time erano tutti a singolo step. Un confronto tra la procedura quantitativa Taq-Man rispetto alla Sybr Green ha dimostrato una maggiore sensibilità per la Sybr Green. Ulteriori prove vanno però effettuate utilizzando maggiore quantità di acidi nucleici nella miscela di amplificazione.

DETERMINAZIONE DI ADENOVIRUS NEL CAMPIONE DI SEDIMENTO MEDIANTE NESTED PCR

INIBITORI DELLA PCR NEL SEDIMENTO Nell’ambito dell’amplificazione di adenovirus per l’eliminazione dell’effetto inbitore sono state provate 4 diverse procedure: aggiunta di polivinilpolipirrolidone (PVPP) durante la procedura di estrazione aggiunta di PVPP alla miscela di amplificazione aggiunta della proteina di “T4 gene Protein” alla miscela di amplificazione diluizione da 1/10 a 1/10.000 del DNA estratto 1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 8 I risultati migliori si sono ottenuti con le procedure 3 e 4: l’aggiunta della “T4 gene Protein” permette di non diluire il DNA estratto la procedura di diluizione non necessita dell’aggiunta di un ulteriore reagente. Non permette, però, di conoscere a priori il fattore di diluizione ideale per ogni campione Campioni con aggiunta della T4 Gene 32 Protein Campioni diluiti da 1:10 a 1:10000

L’utilizzo dello strumento “FastPrep Instrument” (prodotto da Q-Biogene) ha reso notevolmente più semplice, sensibile e ripetibile l’estrazione del DNA e del RNA da sedimento rispetto ad altri metodi finora utilizzati.

CONCLUSIONI ATTIVITA’ DI RICERCA (sett. 04 – dic. 05) Messa a punto di 6 kit in PCR qualitativa (enterovirus, poliovirus, adenovirus, adenovirus 40 e 41, HAV e reovirus) e 2 kit in PCR quantitativa (enterovirus e adenovirus) La determinazione mediante PCR di adenovirus risulta la migliore come indice di contaminazione ambientale in quanto più sensibile, rapida e semplice, sia in acque concentrate che nel sedimento, rispetto alla ricerca di altri virus o microrganismi Data la complessità delle matrici (acque concentrate e sedimenti) va posta particolare attenzione nella fase di estrazione degli acidi nucleici soprattutto per la presenza di inibitori della Taq-polimerasi I laboratori italiani che si occupano di monitoraggio ambientale hanno dimostrato forte interesse per l’attività svolta, questo fa intuire un notevole successo di mercato dei prodotti e servizi sviluppati in tale ricerca.

Analisi delle acque di scarico, prelevati all’uscita dei depuratori di 11 differenti siti già precedentemente analizzate, con l’aggiunta delle determinazioni di reovirus, norwalk virus e rotavirus. - campione negativo + campione positivo / campione non analizzato

L’analisi dei reovirus sono state effettuate sia sul campione TQ (campione di acqua sottoposto solamente al trattamento di decontaminazione e concentrazione) sia sul campione BGM (campione di acqua al quale è stato effettuato anche un passaggio di coltura cellulare su cellule BGM): nessun campione è risultato positivo. L’analisi di norwalk e rotavirus è stata effettuata solamente sul campione TQ in quanto tali virus non crescono su una coltura di cellule BGM. SITO 7 Campione Data prelievo ROTAVIRUS Nested 20504479 TQ 27/04/05 + L’analisi del sito 7 ha rilevato positività ai rotavirus, il dato è stato successivamente confermato mediante sequenziamento. SITO 3 Campione Data prelievo NORWALK Nested 6497 TQ 05/07/05 ? L’analisi dei siti 3 e 8 ha rilevato una probabile positività ai norwalk virus, il dato dovrà essere confermato mediante sequenziamento. SITO 8 Campione Data prelievo NORWALK Nested 20508843 TQ 02/08/05 ?

Norwalk virus Rotavirus SITO 4 9382 SITO 3 6497 9805 SITO 8 8843 Marcatore 50°C 53°C 55°C 57°C 60°C SITO 4 9382 SITO 3 6497 9805 marcatore 50°C 53°C 55°C 57°C 60°C SITO 8 8843 SITO 7 4479 Campione probabilmente positivo da verificare mediante sequenziamento Campione positivo, verificato con sequenziamentro

Sequenza dell’amplificato di rotavirus

Analisi dei risultati ottenuti e confronto tra la positività riscontrate ai diversi virus analizzati, alla presenza di E. coli (determinazione effettuata per noi da ARPAV) ed al tipo di disinfezione presente nei diversi siti E.Coli (UFC/100ml) UFC: unità formanti colonia

NaClO → ipoclorito di sodio CH3CO3H → acido peracetico E.Coli (UFC/100ml) NaClO → ipoclorito di sodio CH3CO3H → acido peracetico

I dati ottenuti hanno confermato ulteriormente come gli adenovirus risultino i migliori indicatori di contaminazione virale delle acque e che il trattamento di disinfezione migliore risulti quello con ipoclorito di sodio rispetto all’utilizzo di acido peracetico o al trattamento con radiazioni UV. Interessante l’analisi del sito 4, dove ad un’elevata presenza di E. coli si somma la positività all’analisi di enterovirus (unico sito positivo), la positivita’ ad adenovirus e l’utilizzo di radiazioni UV come metodo di disinfezione.

Scelta dei siti di campionamento Sono stati scelti 10 siti lagunari di campionamento, nei quali sono stati prelevati 10 litri d’acqua e 100 gr di sedimento mediante una benna o un carotatore, in base alla possibile presenza o meno di virus Enterici -Sito SA1: Mulino Stucky - Canale dei Lavraneri Sito SA2: Rialto - Canal Grande Sito SA3: Ospedale Fatebenefratelli - Rio di Zecchini Sito SA4: Ospedale SS. Giovanni e Paolo - Fondamenta nuove Sito SA5: Santa Marta - Rio delle Terese Sito SA6: Ca’ Giustiniani - Rio delle Eremite Sito SA7: Marghera - Canale Vittorio Emanuele Sito SA8: Fusina - Naviglio del Brenta Sito SA9: Marghera (zona industriale) - Canale dei Petroli Sito SA10: Arsenale - Canale di San Pietro Siti SA3, SA4 e SA10 probabilmente positivi perchè situati nelle vicinanze di Ospedali Siti SA2, SA5 e SA6 probabilmente positivi perchè localizzati in canali nei quali vengono scaricate acque reflue Siti SA1 e SA7 probabilmente negativi perchè situati in aree con notevole ricambio d’acqua Siti SA8 e SA9 presi in considerazione perchè vicini alla zona industriale di Marghera e Fusina

SA3 SA4 SA2 SA10 SA5 SA6 SA1

SA7 SA9 SA8

Carotatore utilizzato per i prelievi di sedimento Benna utilizzata per i prelievi di sedimento

I campioni di acqua prelevati da ogni sito (10 L) sono stati conservati a +4°C per un periodo massimo di due giorni. Sono stati sottoposti al trattamento di decontaminazione e concentrazione, quindi utilizzati per inoculare un monostrato di cellule BGM di coltura cellulare. Sono stati considerati positivi ai virus enterici i campioni che determinavano effetto citopatico dopo un unico passaggio su coltura cellulare (10 giorni). I campioni di sedimento prelevati da ogni sito (100 gr) sono stati conservati a -20°C per un periodo massimo di due giorni. E’ stata quindi effettuata l’estrazione del DNA mediante il FastDNA® SPIN Kit for Soil e il FastPrep® Instrument (Qbiogene) e dell’RNA mediante il FastRNA Pro Soil Direct Kit e il FastPrep® Instrument (Qbiogene). I campioni di DNA ed RNA estratti sono stati analizzati mediante i vari kit Experteam per la determinazione qualitativa dei diversi virus enterici.

Tabella risultati sedimento e acque Sito H2O effetto citopatico Sedimento Adenovirus Sedimento Enterovirus Sedimento HAV Sedimento Reovirus Sedimento Rotavirus Sedimento Norwalk virus SA1 - + SA2 SA3 +/- SA4 SA5 SA6 SA7 SA8 SA9 SA10

Conclusioni relative ai dati sui sedimenti I siti nei quali si riscontra una maggiore positività ai virus Enterici (Adenovirus, HAV e Rotavirus) sono i siti SA1 ed SA4. Il sito SA4 è situato nelle vicinanze dell’Ospedale SS. Giovanni e Paolo. Le acque reflue dell’Ospedale vengono scaricate direttamente in acqua ed è probabile che contengano una maggiore quantità di virus, quindi è plausibile che questo sito sia maggiormente contaminato rispetto ad altri. E’ da chiarire, invece, la causa della positività del sito SA1. Il sito SA3 mostra una debole positività agli Enterovirus nel sedimento e un debole effetto citopatico nelle acque. Questo dato può indicare una correlazione tra presenza di virus nel sedimento e nell’acqua circostante e può confermare l’ipotesi che il sedimento funga da serbatoio di virus presenti nell’acqua. I siti SA2, SA6 ed SA10 sono positivi ai Rotavirus, probabilmente perché le acque reflue della zona sono scaricate direttamente in acqua e nei canali nei quali è stato effettuato il campionamento non vi è un grande ricircolo d’acqua. L’acqua del sito SA8 ha una temperatura superiore alla media, data la presenza degli scarichi della centrale elettrica, e questo può spiegare la positività ai Rotavirus ma non ad altri virus enterici, dato che i Rotavirus sono riscontrati più frequentemente alle temperature più elevate. Il sito SA5 è risultato negativo per tutti i virus Enterici a RNA. I siti SA7 e SA9 sono risultati negativi a tutte le analisi per i virus Enterici a RNA probabilmente perché situati in una zona con grande ricircolo d’acqua e nella quale non vi è scarico di acque reflue.

Conclusioni Dall’analisi dei dati riportati in tabella risulta come la determinazione qualitativa di adenovirus nel sedimento risulti di poca rilevanza, dato che tutti i siti analizzati sono risultati positivi. Sarà quindi neces- sario effettuare la medesima analisi mediante real time PCR (PCR quantitativa) al fine di individuare una possibile scala del livello di inquinamento. Particolarmente interessante in tale ambito risultano invece le determinazioni di HAV e rotavirus, in quanto i campioni di acqua analizzati precedentemente erano sempre risultati negativi a tali virus. Nessun campione analizzato è invece risultato positivo per l’analisi di norwalk virus e reovirus. Appare quindi evidente, anche se in via preliminare, come il significato dei diversi virus enterici rilevabili mediante PCR assuma valore diverso a seconda del tipo di campione analizzato (acqua o sedimento).I dati relativi al sedimento risultano comunque di difficile interpretazione non essendo ancora stata effettuata alcuna analisi in PCR sui campioni di acqua corrispondenti. Ulteriori informazioni si potranno ottenere dall’analisi mediante real time PCR di acqua e sedimento.

PROTOTIPI KIT ALLESTITI

Adenovirus Kit 1 -RQ Campioni d’acqua Concentrazione Estrazione DNA Sistema completo per la quantificazione di Adenovirus in campioni ambientali mediante Real Time PCR. La determinazione quantitativa oltre ad indicare un potenziale rischio sanitario, soprattutto per le categorie a rischio quali bambini, anziani, pazienti immunosoppressi, costituisce un indice di qualità dell’acqua per il suo utilizzo in ambito potabile, ricreativo e lavorativo. Concentrazione PCR QUANTITATIVA Estrazione DNA Campioni d’acqua Risultato : copie di genoma di Adenovirus presenti nel campione d’acqua concentrato per ml