LEZIONE 8 Ingegneria cellulare: CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011-12 Titolare del corso: Adriana Maggi LEZIONE 8 Ingegneria cellulare: Metodi di manipolazione del genoma cellulare Valeria Benedusi

integrazione di DNA esogeno Ingegneria Cellulare Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o integrazione di DNA esogeno

Finalità dell’ingegneria cellulare applicate alla farmacologia Identificazione di bersagli di farmaci Screening di farmaci Produzione di proteine terapeutiche Terapia cellulare

Ingegneria cellulare: i diversi passaggi Identificazione del gene di interesse Scelta della metodologia adeguata (tipo di cellula/modalità di transfezione/infezione) Messa a punto del vettore per la mutagenesi genomica o per la veicolazione nella cellula del gene di interesse Inserimento del vettore nella cellula (transfezione o infezione) Identificazione delle cellule ingegnerizzate Applicazioni

TRANSFEZIONE Trasferimento di materiale esogeno in cellule riceventi eucariotiche (nella gran parte dei casi di mammifero) ed in genere negli organismi modello di riferimento, animali e vegetali Principali difficoltà: far passare attraverso le membrane il DNA tossicità dei metodi: bilancio tra efficienza e sopravvivenza. 5

TRANSFEZIONE II Metodo ideale: alta efficienza di trasferimento del materiale genetico bassa tossicità per le cellule riproducibilità in diversi esperimenti 6

Applicazioni Studio di struttura e funzione di geni Studio dei meccanismi di regolazione dell'espressione genica Produzione di proteine su larga scala Produzione di modelli animali per ricerca Terapia genica 7

Ingegneria cellulare: i diversi passaggi Identificazione del gene di interesse Scelta della metodologia adeguata (tipo di cellula/modalità di transfezione/infezione) Messa a punto del vettore per la mutagenesi genomica o per la veicolazione nella cellula del gene di interesse Inserimento del vettore nella cellula (Transfezione o infezione) Identificazione delle cellule ingegnerizzate Applicazioni

La scelta del sistema cellulare 1. coltura primaria cellula immortalizzata linea tumorale

Scelta del sistema cellulare 2. 1. Facilità di coltura e stabilità 2. Efficienza di transfezione 3. Modificazioni post-traduzionali 4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica 5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)

Ingegneria cellulare: i diversi passaggi Identificazione del gene di interesse Scelta della metodologia adeguata (tipo di cellula/modalità di transfezione/infezione) Messa a punto del vettore per mutagenesi genomica o per la veicolazione nella cellula del gene di interesse Inserimento del vettore nella cellula (Transfezione o infezione) Identificazione delle cellule ingegnerizzate Applicazioni

Scelta del vettore per ingegneria cellulare

La scelta del vettore Determinata dal tipo di sistema che si vuole generare: 1. iperespressione proteica 2. espressione regolata per lo studio della funzione del gene, per produzione limitata nel tempo 3. studio della regolazione della espressione di un gene

VETTORE IDEALE Tropismo di espressione: per garantire la localizzazione del transgene sia a livello trasduzionale (il vettore raggiunge cellule specifiche) che a livello trascrizionale (il gene viene espresso solo in alcune cellule). Durata di espressione: per far sì che la terapia duri nel tempo. Livello di espressione: possibilmente regolabile. Efficacia clinica: test funzionali su modelli animali. Scarsa tossicità.

VETTORI PER TERAPIA GENICA Vettori virali: Vettori non virali: Adenovirus Retrovirus Virus adeno-associati Lentivirus (derivati da HIV) Herpesvirus Plasmidi nudi Elettroporazione in vivo Liposomi Ammine, proteine cariche positivamente

Vettori per ingegneria cellulare sequenze per la replicazione in procariote Cassetta di espressione Polylinker Promotore (virale, tess. specifico,inducibile , ecc.) Modificazioni posttrascrizionali (Siti di: terminazione della trascrizione; poliadenilazione; segnali di splicing ) Marcatori di selezione

Vettori di espressione: il vettore pCI-neo Promotore virale Introne chimerico Polylinker Poliadenilazione Promotore T7 pol Promotore T3 pol Origine di replicazione del fago f1 Neo resistenza Amp resistenza E.Coli ori

T-antigen e cellule COS. L’uso di cellule COS consente di ottenere alti livelli di espressione di proteine esogene senza l’utilizzo di promotori virali forti. Il gene è clonato in un plasmide che include l’origine di replicazione virale di SV40. Le cellule Cos contengono, nel loro genoma, il gene codificante per il T-antigen, una proteina che riconosce l’origine di replicazione di SV40 e stimola una massiccia replicazione del plasmide.

Promotori inducibili: il sistema Tet-on/Tet-off Utilizzando il sistema di regolazione trascrizionale dell’operone responsabile della tetraciclina-resistenza di E. coli è possibile regolare l’espressione di un transgene. Il sistema è composto da un transattivatore chimerico che lega il tet-responsive-element TRE espresso in modo costitutivo (promotore virale o tessuto-specifico) Il gene la cui trascrizione deve venire regolata è sotto il controllo di un promotore contenente TRE 19

Il sistema Tet-on/Tet-off E’ necessario cotransfettare un plasmide contenente il fattore di regolazione ed un plasmide contenente il transgene sotto il controllo trascrizionale di un promotore responsivo alla tetraciclina. pCMV tetR VP16 Tet-OFF Plasmidi codificanti per l’elemento di regolazione pCMV rtetR VP16 Tet-ON TRE Pmin CV Gene of interest Transcription Plasmide contenente il transgene

Il sistema Tet-off basato sulla produzione della proteina transattivante tTA (tetracycline-controlled transactivator protein) è represso in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina In presenza di tetraciclina tTA si stacca da TRE e il gene non è più trascritto

Il sistema Tet-On basato sulla produzione della proteina transattivante rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator protein) è indotto in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina In presenza di tetraciclina rtTA si lega a TRE e il gene viene più trascritto

Ingegneria cellulare: i diversi passaggi Identificazione del gene di interesse Scelta della metodologia adeguata (tipo di cellula/modalità di transfezione/infezione) Messa a punto del vettore per mutagenesi genomica o per la veicolazione nella cellula del gene di interesse Inserimento del vettore nella cellula (Transfezione o infezione) Identificazione delle cellule ingegnerizzate Applicazioni

Scelta della tecnica di transfezione Infezione con vettori virali Metodi biochimici Coprecipitazione con calcio fosfato Adsorbimento mediante DEAE-destrano Lipofezione Metodi fisici Elettroporazione Microiniezione Infezione con vettori virali

Coprecipitazione con calcio fosfato La coprecipitazione di aggregati calcio fosfato-DNA sulla superficie cellulare favorisce l’internalizzazione dell’acido nucleico Vantaggi: Molto semplice Buona efficienza (5-40%) Piuttosto riproducibile Economico Svantaggi: Tossicità cellulare Tecnicamente delicato, sono determinanti: Taglia e dimensioni del precipitato Variazioni anche minime del pH Non funziona con alcuni tipi cellulari

DEAE-destrano Primo metodo utilizzato per l’introduzione massiva di DNA in un cellula eucariotica Destrano: polisaccaride costituito da unità di D-glucosio che associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile) è in grado di legare i gruppi fosfato carichi negativamente del DNA e di mediarne l’ingresso attraverso le membrane (endocitosi). Le cellule vengono preparate mediante shock osmotico con glicerolo o DMSO Vantaggi: molto semplice Svantaggi: poco efficiente (elevata degradazione DNA, scarsa penetrazione nel nucleo) solo trasfezioni transienti utilizzato in cellule ad elevata attività endocitotica

Trasferimento di DNA mediato da liposomi Lipofezione Trasferimento di DNA mediato da liposomi In particolari condizioni è possibile ottenere liposomi contenenti DNA DNA La struttura del doppio strato fosfolipidico facilita la fusione con la membrana cellulare ed il rilascio del DNA nel citosol Buona efficienza Scarsa citotossicità Riproducibilità

Lipofezione Metodica vantaggiosa : il DNA viene rilasciato efficientemente in diversi tipi cellulari i liposomi sono semplici da utilizzare in quanto non richiedono apparati o accorgimenti particolari 28

Lipofezione con reagenti lipidici neutri I liposomi sono delle sfere di membrane sintetiche che possono essere riempite con DNA. Esse fondono spontaneamente con le membrane cellulari rilasciando il loro contenuto nel citoplasma. Sono disponibile commercialmente dei kit per la semplice preparazione dei liposomi.

Lipofezione con reagenti lipidici cationici (LipofectamineTM, OligofectamineTM, CellfectinTM) Reagenti lipidici cationici in soluzione acquosa formano piccoli (100-400 nm) liposomi unilamellari. La superficie carica positivamente attrae il DNA (-). Il DNA non è propriamente “incapsulato” nel liposoma ma piuttosto legato alle sue superfici. Ogni plasmide si lega a 2-4 liposomi. L’internalizzazione del costrutto è via endosomi e lisosomi.

Lipofezione con reagenti dendrimerici attivati Particolari reagenti commerciali, definiti dendrimerici, possiedono un’architettura sferica, che si ramifica radialmente da un core centrale e termina con gruppi amminici ionizzati. Tali reagenti complessano il DNA in strutture compatte ottimizzando l’internalizzazione del DNA nella cellula. Il complesso DNA-dendrimero possiede una carica netta di segno positivo, che favorisce il legame a recettori con carica negativa (ex. Glicoproteine sialilate). Una volta all’interno della cellula, il reagente tampona il pH del lisosoma riducendo la degradazione del vettore.

Transfezione con PEI Vantaggi: Favorisce il passaggio Macromolecola organica con elevata capacità di cariche positive: ogni tre atomi c’è un gruppo amminico che può essere protonato Il complesso PEI-DNA all’interno dell’endosoma si lega ai protoni stimolando l’ingresso degli ioni cloro, questo porta alla rottura dell’endosoma con conseguente rilascio del complesso nel citoplasma Vantaggi: Favorisce il passaggio nucleo-citoplasma Economico Svantaggi: Tossicità cellulare Efficienza non sempre elevata

Elettroporazione Le cellule vengono concentrate, miscelate con il DNA da transfettare e collocate in una cella collegata a degli elettrodi. Un breve impulso elettrico apre in maniera reversibile dei “buchi” nelle membrane cellulari. Il DNA entra nelle cellule che vengono piastrate in terreno fresco. Vantaggi: Minore esposizione a endonucleasi Svantaggi: Alta % di cellule che non sopravvi- -vono al trattamento Adatta a cellule con membrane particolarmente resistenti Adatta a cellule in sospensione

Microiniezione Elevata efficienza (iniezione diretta nel nucleo) Impossibile applicazione su larga scala Grande manualità dell’operatore Applicazioni particolari (topi transgenici, espressione di mRNA in cellule di Xenopus laevis)

Microiniezione

Esempio: generazione di topi transgenici mediante microiniezione di DNA nei pronuclei maschili Iniezione di costrutti di espressione lineari, che si integrano sotto forma di concatameri a partire dai primissimi stadi di sviluppo. ATG * Promotore Introne 1 2 3 4 5 Poly-A CDS Dopo la microiniezione gli embrioni vengono reimpiantati in femmine pseudogravide Gli animali nati da questi esperimenti devono essere analizzati per mezzo di Southern blotting o PCR per valutare se il transgene si è integrato e in quante copie. Gli animali transgenici (founders e/o loro discendenza) vengono successivamente analizzati per valutare se il transgene si esprime in tutte le cellule, ed eventualmente gli effetti fenotipici della sua espressione