La catena respiratoria e la fosforilazione ossidativa Dott.ssa A. R. M. Sabbatini - Università degli Studi di Pisa

L’uomo è un organismo aerobio pertanto non può vivere in assenza di ossigeno. L’ossigeno respirato a livello polmonare (respirazione polmonare), trasportato ai tessuti mediante l’emoglobina, è utilizzato a livello cellulare per ossidare i nutrienti capaci di donare energia (respirazione cellulare) Le molecole ricche di energia (carboidrati, acidi grassi, amminoacidi) sono metabolizzate a livello cellulare in una serie di reazioni di ossidazione che portano alla formazione di CO2 e di H2O. Nei mitocondri avvengono diverse reazioni ossidoriduttive (decarbossilazione ossidativa del piruvato, ciclo di Krebs, b-ossidazione etc.) nelle quali i substrati si ossidano cedendo elettroni a specifici coenzimi, come il NAD+ e il FAD, che si riducono.

I Mitocondri Membrana esterna liberamente permeabile alla maggioranza degli ioni e delle piccole molecole. Membrana interna insolitamente ricca di proteine (inclusi i complessi ATP sintasi che protrudono nella matrice mitocondriale) impermeabile alla maggior parte degli ioni (compresi H+, Na+ , K +), ad ATP, ADP, piruvato ed altri metaboliti importanti per la funzione mitocondriale. Il trasporto di molecole può avvenire grazie a trasportatori specializzati. Matrice simile ad un gel, è composta per il 50% da proteine contiene NAD+ e FAD, ADP e Pi, mtDNA, mtRNA, enzimi (per l’ossidazione di piruvato, AA ed acidi grassi; per il TCA; per parte della sintesi dell’urea e dell’eme).

La Catena Respiratoria Nei mitocondri avvengono diverse reazioni ossidoriduttive (decarbossilazione ossidativa del piruvato, ciclo di Krebs, b-ossidazione etc.) nelle quali i substrati si ossidano cedendo elettroni a specifici coenzimi, come il NAD+ e il FAD, che si riducono a NADH e FADH2. A livello della membrana mitocondriale interna è collocata la catena di trasporto degli elettroni attraverso la quale, mediante un sistema di reazioni ossidoriduttive consecutive, gli elettroni dal NADH e FADH2 vengono trasferiti all’O2. Questo complesso di reazioni prende il nome di CATENA poiché gli elettroni vengono ceduti all’O2 attraverso passaggi intermedi; si aggiunge l’aggettivo RESPIRATORIA poiché si consuma ossigeno.

Champe et al., Le basi della biochimica, Ed. Zanichelli

Dalla membrana mitocondriale interna si possono separare 5 distinti complessi enzimatici (Complesso I, II, III, IV e V). I Complessi I-IV fanno parte della catena di trasporto degli elettroni . Ciascun Complesso accetta o dona elettroni a trasportatori di elettroni intermedi (Coenzima Q e Citocromo c), dotati di una certa libertà di movimento. Ciascun trasportatore riceve e- da un donatore e li cede al trasportatore successivo della catena (gli e- fluiscono dalle coppie ox/red a potenziale più elettronegativo a quelle a potenziale più elettropositivo). Gli e- infine si combinano con l’ O2 e con i protoni, formando molecole di H2O. Il Complesso V (ATP sintasi) catalizza la sintesi dell’ATP.

Le reazioni della catena di trasporto degli elettroni 1) Formazione del NADH. Il NAD+  NADH ad opera di deidrogenasi che rimuovono 2 atomi di H dal loro substrato. Entrambi gli e- ma un solo H+ si trasferiscono al NAD+ (nell’insieme uno ione idruro :H-). Si formano così il NADH e un H+ libero. 2) NADH deidrogenasi. Il H+ libero e lo ione idruro (H-) trasportato dal NADH si trasferiscono al Complesso I (NADH deidrogenasi) . Al Complesso I è saldamente legata una molecola di Flavina mono-nucleotide (FMN) che accetta i 2 atomi di H (2 e- + 2 H+ ), trasformandosi in FMNH2. La NADH deidrogenasi contiene vari atomi di Fe coordinati ad atomi di S (centri ferro-zolfo), che permettono di trasferire gli e- al componente successivo della catena (Coenzima Q) grazie al passaggio del Fe da Fe+++ a Fe++.

3) Coenzima Q (CoQ) o Ubichinone. Il coenzima Q può accettare atomi di H sia dal FMNH2 (prodotto dalla NADH deidrogenasi) sia dal FADH2 prodotto dalla succinato deidrogenasi (Complesso II). Altri substrati trasferisono e- al CoQ tramite flavoproteine p.es. acil CoA deidrogenasi (b-ossidazione degli acidi grassi), ma non attraverso il Complesso II. Il CoQ può accettare uno o due elettroni, trasformandosi nella forma semichinonica o in quella completamente ridotta.

4) Citocromi. I restanti componenti della catena di trasporto degli e- sono dei citocromi. I citocromi sono proteine coniugate, appartenenti al gruppo delle emoproteine. Si distinguono diversi citocromi (a, b, c) in base ai sostituenti legati all’anello porfirinico. Ciascuno di essi contiene un gruppo EME in cui l’atomo di ferro oscilla alternativamente tra lo stato ossidato Fe 3+ e lo stato ridotto Fe 2+, permettendo il trasporto di e-. Le forme ridotte non possono essere riossidate dall’O2 ma soltanto da un altro citocromo, secondo il proprio potenziale di ossidoriduzione. Solo il citocromo a3 è auto-ossidabile e scarica gli e- sull’ O2, costituendo l’ultimo anello della catena.

Il Complesso IV (citocromo ossidasi) è l’unico trasportatore di e- nel quale il Fe dell’ eme può reagire direttamente con l’O2. Contiene il citocromo a, a3 e rame. E’ bloccato dagli ioni CN-. Il Complesso IV è costruito in modo da non lasciar sfuggire derivati dell’ossigeno parzialmente ridotti (ROS). La superossido dismutasi, enzima sia mitocondriale che citoplasmatico, è in grado di distruggere radicali superossido (O-2) eventualmente sfuggiti. Ha una funzione tipicamente protettiva (neutralizza immediatamente i radicali superossido formati nel corso del metabolismo) catalizzando la reazione: 2 O-2 + 2 H+  H2O2 + O2

La Fosforilazione Ossidativa Nel percorrere la catena di trasporto, gli elettroni perdono gran parte della loro energia libera. Parte di questa energia è trattenuta mediante la produzione di ATP a partire da ADP e fosfato inorganico (Pi) (FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA). La quota di energia libera che non è trattenuta sotto forma di ATP viene dissipata come calore. Il trasferimento di elettroni lungo la catena respiratoria è favorito sul piano energetico (il NADH è un potente donatore di elettroni e l’O2 è un avido accettore di elettroni). Tuttavia il flusso di elettroni dal NADH verso l’ O2 non ha come esito diretto la formazione di ATP.

Ipotesi chemiosmotica di Mitchell Spiega in che modo l’energia libera generata dalla catena respiratoria possa essere utilizzata per formare ATP. 1) Pompa protonica. Durante il trasporto di elettroni, attraverso la membrana mitocondriale interna avviene anche un trasporto di protoni (H+), dalla matrice allo spazio intermembranale . Questo processo crea un gradiente elettrico (con una quantità di cariche positive maggiore all’esterno della membrana) ed un gradiente di pH (all’esterno della membrana il pH è più basso rispetto all’interno). L’energia generata da tale gradiente protonico (g. elettrochimico) è utilizzata per la sintesi di ATP. Il gradiente protonico è quindi l’intermedio che accoppia l’ossidazione alla fosforilazione.

Champe et al., Le basi della biochimica, Ed. Zanichelli

2) ATP sintasi. Il complesso enzimatico della ATP sintasi (Complesso V) produce l’ATP, utilizzando l’energia del gradiente protonico. I protoni, dopo essere stati trasferiti sul versante citosolico della membrana mitocondriale interna, rientrano nella matrice mitocondriale attraverso un canale all’interno del complesso dell’ATP sintasi. (N.B. La membrana mitocondriale interna è impermeabile ai H +) Durante il flusso di protoni, all’interno del complesso dell’ATP sintasi avviene la sintesi di ATP a partire da ADP e Pi mentre il gradiente elettrochimico viene dissipato. N.B. L’enzima ATP sintasi è chiamato anche ATPasi mitocondriale perché, se isolato, catalizza anche l’idrolisi dell’ATP ad ADP+Pi

Accoppiamento Il trasporto degli elettroni (catena respiratoria) e la sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa) avvengono in modo continuo in tutti i tessuti che contengono mitocondri. La catena respiratoria e la fosforilazione ossidativa sono strettamente accoppiate: l’una può avvenire solo se avviene anche l’altra: - se il gradiente protonico non è consumato, la catena respiratoria cessa perché diventa impossibile termodinamicamente aumentare il gradiente di protoni; - se la catena respiratoria cessa, la fosforilazione consuma il gradiente protonico fino a che questo non è più sufficiente per la sintesi di ATP.

Il trasporto degli elettroni e la fosforilazione ossidativa possono essere disaccoppiati da composti che  la permeabilità della membrana mitocondriale interna ai protoni (H+). Questi agenti, detti disaccoppianti, sono capaci di dissipare il gradiente elettrochimico generato dal trasporto elettronico, producendo calore: si realizza un  della respirazione e un  del consumo di substrati accompagnati da un effetto termogenetico. a) Un classico disaccoppiante di sintesi è il 2,4-dinitrofenolo. b) A dosi elevate, l’aspirina disaccoppia la fosforilazione ossidativa (ciò spiega la febbre che accompagna l’assunzione di dosi tossiche del farmaco). c) L’effetto termogenetico dell’ ormone tiroideo tiroxina (T4) è dovuto alla sua azione disaccoppiante.

Fisiologicamente, la dissipazione del gradiente protonico per produrre calore avviene nel tessuto adiposo bruno. Qui è presente una proteina (termogenina) che controlla la permeabilità della membrana mitocondriale interna verso gli H+. La termogenina, come altre proteina disaccoppianti (UCP), crea una “falla” che permette ai protoni di rientrare nella matrice mitocondriale senza che l’energia sia utilizzata per sintetizzare ATP: l’energia libera si disperde sotto forma di calore. Il grasso bruno, a differenza del più comune grasso bianco, in risposta al freddo disperde quasi il 90% dell’energia respiratoria nella termogenesi. Tale processo è attivo alla nascita e nella fase di risveglio degli animali ibernanti.

I sistemi di trasporto di membrana La membrana mitocondriale interna è impermeabile a moltissime sostanze dotate di carica elettrica (idrofiliche). Essa contiene numerose proteine di trasporto che permettono il passaggio di molecole specifiche dal citosol (più precisamente dallo spazio intermembranale) alla matrice mitocondriale. 1) Lo scambio ATP-ADP. Trasportatori specifici trasferiscono l’ADP ed il Pi dal citosol ai mitocondri, dove è risintetizzato l’ATP. Un trasportatore specifico dei nucleotidi adenilici trasferisce una molecola di ADP dal citosol all’interno dei mitocondri, esportando al contempo una molecola di ATP. Il Pi passa dal citosol ai mitocondri grazie ad un trasportatore del fosfato.

2) Il trasporto degli equivalenti riducenti. Il NADH prodotto nel citosol non può entrare nei mitocondri perché, a livello della membrana mitocondriale, mancano specifiche proteine trasportatrici del NADH. Dei sistemi navetta (shuttle) rendono possibile il trasferimento dal citosol ai mitocondri di 2 e- del NADH (“equivalenti riducenti”). Shuttle del glicerofosfato. Avviene il trasferimento di 2 e- dal NADH ad un sistema flavoproteico presente sulla membrana mitocondriale interna che convoglierà gli e- verso la catena respiratoria. Shuttle malato-aspartato. Nel citosol, l’ossalacetato si riduce a malato (e si riforma NAD+). Il malato entra nel mitocondrio scambiandosi col chetoglutarato. La malato deidrogenasi ossida il malato ad ossalacetato  NADH che trasferirà 2 e- alla catena respiratoria.

Regolazione del metabolismo energetico Le attività dei sistemi che producono e che consumano energia rispondono direttamente al rapporto del fosfato ad alta energia rispetto al contenuto totale in nucleotidi adenilici. 1/2 [ADP] + [ATP] Carica energetica = [AMP] + [ADP] + [ATP]

FINE