Casi clinici del mercoledì UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI NAPOLI “FEDERICO II” Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Specializzazione in Pediatria Casi clinici del mercoledì “Ipotonia, acidosi lattica, anemia ipocromica: sospetto di patologia mitocondriale?” Tutor Dott. N. Brunetti-Pierri AIF Dott.ssa G. Cappuccio

Paolo, 3 anni e 10 mesi Motivo del ricovero: approfondimento diagnostico per ipotonia, ritardo dello sviluppo psicomotorio, lievi note dismorfiche, anemia I II III Anamnesi familiare: non contributoria; madre con riferito tratto talassemico Anamnesi personale gravidica e perinatale: all’ecografia praticata in 16esima settimana di gestazione evidenza di cisti dei plessi corioidei, non evidente alle successive ecografie. Amniocentesi: cariotipo: 46, XY. Storia di MAF ridotti. APGAR 1’8, 5’9. Peso 3.060 Kg (10°-25° ct), Lunghezza 49 cm (10°- 25° ct), OFC: 34.5 cm (-2DS/M). Alla nascita evidente ipotonia con riscontro di iperCKemia isolata (1550 con v.n. 250- 500 UI/ml)

Ipotonia Anamnesi personale patologica remota: Approfondimento diagnostico presso L’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù dove pratica valutazione di primo livello con esecuzione di: Lattato sierico 66.15 mg/dl (valori di riferimento 10- 60 mg/dl) Profilo tiroideo: nella norma Aminoacidemia, acilcarnitine nella norma Acidi organici urinari: nella norma Cariotipo standard: 46, XY Analisi di metilazione PWS: neg Isoelettrofocusing della trasferrina: nella norma Alfa-glucosidasi acida: negativo ECG ed eco-cardio: neg RMN encefalo con spettroscopia: ipomielinizzazione, picco di lattato a destra e riduzione delle dimensioni del corpo calloso

Malattia mitocondriale? Ipotonia Successivamente secondo consulto presso il Gaslini ove pratica: EAB: pH 7.27, HCO3 16 mmol/L (21-28 mmol/L) Neurotrasmettitori e pterine plasmatiche urinarie e liquorali: nella norma EEG: evidenza di un focolaio epilettogeno in sede temporale posteriore di destra EMG: il tracciato non evidenzia la presenza di sicuri segni di sofferenza neurogena o miogena sul settore esaminato PEV: OD tracciato a morfologia regolare con tempo di latenza aumentato ed ampiezza ridotta; OS tracciato nei limiti della norma per morfologia, ampiezza e tempo di latenza. RMN encefalo: negativa Malattia mitocondriale? Terapia: Keppra fl 150 ml: 100 mg (pari a 15 ml)/die Vitamina B2 cp 10 mg_; 1 cpr/die Sodio Bicarbonato; 5 mEq/L per 3 volte/die Carnitene fl 1 g/10 ml: ¼ fl due volte/die Vitamina B1 cpr 300 mg; 1 cpr/die Biotina cpr 5 mg: 1 cpr due volte/die Ubidecarenone fl: ¼ fl due volte/die Fisioterapia e psicomotricità

Malattia mitocondriale? Analisi istologica su biopsia muscolare: Discreta variabilità del calibro fibrale, con presenza di fibre di dimensioni leggermente diminuite e fibre normodimensionate. Non si evidenziano fenomeni necrotici, né degenerativi, né infiammatori. Numerose fibre presentano delle microvacuolizzazioni, otticamente vuote. Con le ATPasi miofibrillari si ottiene una buona differenziazione tipologica fibrale con matenimento del mosiaco distributivo. Si osserva una riduzione generalizzata della colorazione per la COX. Con l’Oli red O si riscontra la presenza di microgocciole lipidiche nella maggior parte delle fibre soprattutto in quelle appartenenti al I tipo. Il quadro istopatologico evidenzia una sofferenza muscolare con elementi suggestivi per un’alterazione dismetabolica ossidativa con accumulo di lipidi intracitoplasmatici.

Malattia mitocondriale? Attività enzimatica della catena respiratoria: Il dosaggio degli enzimi della catena respiratoria evidenzia una riduzione di tutti i complessi dosati sia nei valori assoluti che nella valutazione relativa (attività enzimatiche dei complessi espresse come rapporto rispetto all’enzima della citrato sintetasi). Si evidenzia in modo particolare la riduzione dei valori di Citocromo ossidasi (COX complesso IV) con una attività residua del 15%. Valori dosati μg/μL Range di riferimento μg/μL NADH 11.51 (27.5- 39.5) Succinato Deidrogenasi 0.31 (0.5- 0.75) COX 0.30 1.8- 2.45 Citrato sintasi 13.02 (7.8- 10.9) Malattia mitocondriale? Sequenziamento dei geni mitocondriali MTCO1, MTCO2, MTCO3 codificanti rispettivamente per le subunità I, II e III del complesso IV: non evidenti mutazioni nei geni codificati dal mtDNA.

Giunge alla nostra osservazione… Età 3 anni e 10/12, Peso= 10.12 Kg (<< 5° ct), Lunghezza= 89.5 cm (<< 5° ct), OFC= 49 cm (- 2DS/M) Esame obiettivo all’ingresso: Bozze frontali prominenti, facies allungata, rima buccale aperta, dismorfismi auricolari. Motricità limitata dall’ipostenia, presenza di movimenti afinalistici di capo ed arti con tendenza al sorriso afinalistico. ROT rotulei elicitabili con difficoltà. Ipotonia muscolare generalizzata, trofismo muscolare ai limiti inferiori della norma. Mantiene la posizione seduta imposta con sostegno bimanuale. Buon controllo del capo, lassità legamentosa alle estremità distali degli arti. Deambulazione autonoma non possibile. Con sostegno attivo bimanuale accenna qualche passo. Deviazione ulnare delle dita delle mani. Atteggiamento cifotico della colonna.

Esami di laboratorio: Acido lattico: 3.8 mmol/L (v.n. <2.2 moml/L) Isoelettroforesi dell’ Hb: riscontro di HbA2: 2.5% (2.1- 3.3%), HbF: 1.3% (0- 2%) Emocromo: 20.01.2012 06.04.2012 14.07.2012 Hb 9.3 g/dl 9.8 g/dl 8.2 g/dl RBC 4.85 *10^6/μL 5.12 *10^6/μL 4.9 *10^6/μL MCV 69 fl (70-91 fl) 62.8 fl 57 fl MCH 21 picogr (23- 33 pg) 19 pg 16.8 pg MCHC 30.5 μ g/dl (23- 33) 30 μ g/dl 29.5 μ g/dl Sideremia 68 (16- 124 gr/dl) 80 gr/dl Ferritina 32 (20 200 ng/ml) 40 ng/ml Trasferrina 2.2 g/L Acido lattico: 3.8 mmol/L (v.n. <2.2 moml/L) Aminoacidemia ed acilcarnitine: nella norma; non riscontro di aumento di alanina. Indici di funzionalità epatica, pancreatica e renale: nella norma; CPK: nella norma Screening celiachia: neg

Consulenze specialistiche Indagini strumentali: Ecografia addominale: negativa. Studio di velocità di conduzione motoria e sensitiva: nella norma; EMG: nella norma Consulenze specialistiche Consulenza NPI: Griffith-scales: QS 49 Visita oculistica: nella norma ABR: nella norma

Differential diagnosis of neuromuscolar disorders presenting in Newborns The Floppy Infant : Evaluation of Hypotonia, Dawn E. Peredo and Mark C. Hannibal, Pediatrics in Review 2009

Diagnosi differenziale Sede della lesione Centrale Motoneurone Nervo Giunzione neuromuscolare Muscolo Disturbi corrispondenti EII, alterazioni cromosomiche, errori congeniti del metabolismo, disgenesie cerebrali, traumi spinali e cerebrali Atrofia muscolo spinale Neuropatie periferiche Sindromi miasteniche e botulismo Miopatie congenite, metaboliche, distrofie muscolari congenite, distrofie miotoniche Pattern di distribuzione topografica della debolezza Debolezza assiale, prevalentemente senso prossimo distale, forza muscolare nella norma Debolezza ed ipotonia generalizzata, in senso prevalentemente prossimo distale Interessamento dei muscoli distali, debolezza con ipotrofia, prevalente in senso disto-prossimale Generalizzata, prevalente coinvolgimento dei muscoli bulbari oculomotori Senso prossimo distale ROT N o ipoeccitabili, evoluzione verso l’iperreflessia in caso di lesioni centrali Assenti Ridotti Normali EMG Normale Fascicolazioni e fibrillazioni Fibrillazioni Risposta decrementale (miastenia), risposta incrementale (botulismo) Potenziali di unità motoria di breve durata e di ampiezza ridotta e potenziali miopatici polifasici Biopsia muscolare Pattern di denervazione Pattern miopatico Altro Note dismorfiche, anomalie funzionali e strutturali del SNC, convulsioni, nistagmo, apnea, alterazioni stato di coscienza, singhiozzo Difficoltà alimentari, fascicolazioni e tremore intenzionale, artrogriposi alla nascita Deficit della sensibilità, aumento proteine nel liquor, biopsia del nervo alterata Atrogriposi, ptosi, difficoltà alimentari; risposta alla neostigmina (miastenia), stipsi e pupille non reagenti (botulismo) Variabile aumento degli enzimi muscolari

Diagnosi differenziale Disordini della biogenesi perossisomiale: Spettro di patologie 1- Zellweger 2- Adrenoleucodistrofia neonatale X-l 3- Refsum 4- Condrodisplasia puntata rizomelica (CDPR) Clinica: ipotonia, dismorfismi facciali, ritardo dello sviluppo psicomotorio, disfunzione epatica, distrofia retinica, ipoacusia, cisti renali, insufficienza surrenalica, neuropatia periferica… Diagnosi: VLCFA: C26:0, C26:1, C24/C22 C26/C22 acido pristanico e fitanico: plasmalogeni eritrocitari: acido pipecolico: Pattern differente nella CDPR Disordini del metabolismo della creatina: Deficit arginina-glicina aminotrasferasi (AGAT) AR Deficit guanidino-acetato metiltrasferasi (GAMT) AR Deficit del trasportatore della creatina (CRTR) X-l Clinica: ipotonia, atassia, ritardo dello sviluppo psicomotorio, convulsioni, movimenti distonici, ipercinetici Diagnosi: creatina creatinina nel sangue ed urine per AGAT e GAMT creatina/creatinina urine: CRTR Guanidinoacetato: GAMT AGAT Peroxisomal disorders, Baumgartner MR, Saudubray JM., Semin Neonatol. 2002 Creatine and creatine deficiency syndromes: biochemical and clinical aspects, Nasrallah F, Feki M, Kaabachi N. Pediatr Neurol. 2010

Diagnosi differenziale Analisi di metaboliti perossisomiali plasmatici: moderato aumento isolato di C26:0 riferibile all’emolisi presente nel campione; acido fitanico, acido pristanico nel plasma: negativi Metaboliti della creatina su plasma ed urine: nella norma;

Score malattia mitocondriale Mitochondrial disease criteria Diagnostic applications in children E. Morava, Neurology 2006

Mitocondriopatie mtDNA & nDNA Fattori ambientali? DISFUNZIONE DELLA CATENA RESPIRATORIA MITOCONDRIALE Eteroplasmia Effetto soglia Differente espressione tissutale mtDNA & nDNA Più di 100 geni nucleari sono associati ad una compromissione energetica cellulare DISFUNZIONE DELLA CATENA RESPIRATORIA MITOCONDRIALE PREVALENZA 11.5: 100.000 (CIRCA 1: 8500) CON VARIABILITA’ GEOGRAFICA MUTAZIONI mtDNA o DNA NUCLEARE FENOTIPO ESTREMAMENTE VARIABILE Riportate circa 200 mutazioni missense, grandi riarrangiamenti, deplezione Fattori ambientali? N Engl J Med 2003;348:2656-68. GeneReviews, Taylor RW, Mitochondrial DNA mutations in human disease, Nature Reviews Genetics, 2007 15

Diagnosi di malattia mitocondriale Analisi di primo livello Emogas analisi, lattato, CPK, AST, ALT Aminoacidemia, acidi organici urinari ECG Analisi di secondo livello RMN- encefalo con spettroscopia, EEG, EMG, Eco-cardio Esame del liquor Visita oculistica, audiologica Analisi di terzo livello Biopsia muscolare (analisi istopatologica, biochimica, microscopia elettronica) Analisi del mtDNA (sequenziamento, ricerca di delezioni, deplezione del mtDNA), e del nDNA

Analisi diagnostiche nel sospetto di patologia mitocondriale effettuate Acido lattico nel plasma: aumentato (picco alla spettroscopia) Biopsia muscolare: accumulo di lipidi intracitoplasmatici Analisi biochimica: riduzione in particolare dei livelli della COX Analisi molecolare delle subunità del complesso IV (COX): neg Assenti altri segni indicativi ed orientativi per una specifica patologia mitocondriale (disturbi gastrointestinali, lesioni tipiche dei nuclei della base alla RMN-encefalo, oftalmoplegia progressiva, retinite pigmentosa etc etc) Trattamento

OMIM Acidosi lattica Miopatia Anemia

MLASA Condizione rara associata ad insorgenza precoce di miopatia, con acidosi lattica ed anemia sideroblastica Si associa alla presenza di fibre ragged-red e COX-negative alla biopsia muscolare Dovuta a mutazioni missense nei geni nucleari PUS1 e YARS2 coinvolti nel meccanismo di traduzione del mtDNA, che si associa ad una marcata deficineza nell’attività del complesso IV Possibili note dismorfiche (micrognazia, filtro lungo, palato ogivale), microcefalia, ritardo mentale Anemia sideroblastica= ipocromica, microcitica talvolta normocitica. La percentuale di saturazione del Fe nel nostro caso corrispondeva a : (80 mg/dl/220 mg/dl+1.25)+ 100= 30% (v.n. 15-45%) Anemia Nonsense mutation in pseudouridylate synthase 1 (PUS1) in two brothers affected by myopathy, lactic acidosis and sideroblastic anaemia (MLASA),  Zeviani M., BMJ Case Rep. 2009; Mutation of the mitochondrial tyrosyl-tRNA synthetase gene, YARS2, causes myopathy, lactic acidosis, and sideroblastic anemia--MLASA syndrome., Riley LG, Am J Hum Genet. 2010.

MLASA Negativa Analisi in corso e… Prospettive future… L’analisi molecolare per PUS1 e YARS2 è risultata…. Negativa Analisi in corso e… Array-CGH Application of oligonucleotide array CGH in the detection of a large intragenic deletion in POLG associated with Alpers Syndrome. Compton, 2011 Prospettive future…

Take-home messages L’ipotonia muscolare è una manifestazione che sottende a molteplici cause! Per la marcata eterogeneità fenotipica delle patologie mitocondriali è fondamentale far riferimento a dei criteri e a score diagnostici Per il coinvolgimento multisistemico delle patologie mitocondriali considerare anche i segni e sintomi apparentemente indipendenti Il processo di diagnosi è multifasico è prevede un approccio multispecialistico L’eziologia del difetto può rimanere “unknown”

Consulenza neurologica: Partecipazione e l’interazione con l’ambiente appaiono ridotti. Non riferita disfagia. La deambulazione possibile con appoggio bilaterale e sembra essere tendenzialmente steppante. La stazione eretta è possibile solo con appoggio. La motilità spontanea appare globalmente ridotta. In particolare per gli arti superiori flette l’avambraccio sul braccio e le mani appaiono in atteggiamento cadente. Agli arti inferiori presenti movimenti di flesso-estensione delle cosce e di flessione plantare dei piedi mentre appaiono ridotti i movimenti di estensione dei piedi. ROT fiacchi ma presenti. Ipotonia generalizzata più evidente distalmente. Non apparenti disturbi della sensibilità. Quadro compatibile con miopatia mitocondriale.

Flow-chart diagnosis Current molecular diagnostic algorithm for mitochondrial disorders, Lee-Jun C. Wong, Molecular Genetics and Metabolism, 2010

Flow-chart diagnosis Current molecular diagnostic algorithm for mitochondrial disorders, Lee-Jun C. Wong, Molecular Genetics and Metabolism, 2010

Score I disordini della catena respiratoria mitocondriale possono essere causati sia da mutazioni nel DNA mitocondriale che nel DNA nucleare. Patologia eterogenea sul piano clinico Mancanza di semplice biomarkers definitivi