Alla ricerca di segni di pressione selettiva in Homo Sapiens Sergio Cocozza Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare Università “Federico II” Napoli Gruppo Interdipartimentale Bioinformatica e Biologia Computazionale

“Niente in Biologia è di senso se non alla luce dell’Evoluzione” Theodosius Dobzhansky (1900-1975)

“Niente in Biologia è di senso se non alla luce dell’Evoluzione” ed in Medicina “Niente in Biologia è di senso se non alla luce dell’Evoluzione” Theodosius Dobzhansky (1900-1975)

Un problema “pratico” Se vuole guarire deve smettere di fumare. Il fumo fa venire il cancro... fa male alla circolazione ... ecc ecc

Un problema “pratico” Se vuole guarire deve smettere di fumare. Sciocchezze ! Mio nonno è morto a 100 anni fumando sigari toscani ! Se vuole guarire deve smettere di fumare. Il fumo fa venire il cancro... fa male alla circolazione ... ecc ecc

Malattie Multifattoriali 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 gene b gene d ambiente y ambiente x gene a gene c 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

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Varianti rare e varianti frequenti: chi è il colpevole ?

Teorie a confronto Common Disease/Rare Allele (CD/RA) Common Disease/Common Variant (CD/CV) La maggior parte delle mutazioni che causano malattie complesse sono avvenute recentemente, dopo la divergenza delle popolazioni. La conseguenza è l’attesa di una forte eterogeneità nei geni di suscettibilità per le malattie complesse Varianti alleliche esistenti prima della dispersione degli umani sulla terra o varianti alleliche sottoposte a pressione selettiva rappresentano una proporzione significativa degli alleli di suscettibilità per le malattie complesse. La conseguenza è l’attesa di una minore eterogeneità nei geni di suscettibilità per le malattie complesse Alta penetranza (monogenia) Bassa penetranza (poligenia) Bassa penetranza

Pressione selettiva: adattamento e malattia ? Ambiente Genoma ? Adattamento Malattia

Genotipo “frugale” Accumula peggio i grassi Accumula meglio i grassi

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Evolution in Health and Medicine PNAS January 26, 2010; 107 Sackler Colloquium

Strumenti per lo studio della pressione selettiva Grado di differenziazione genetica delle popolazioni umane (Fst) Omozigosità estesa degli aplotipi (iHS)

Normale grado di differenziazione delle popolazioni (deriva genica)

Più alto grado di differenziazione delle popolazioni

Più basso grado di differenziazione delle popolazioni

Fst FST misura le differenze nelle frequenze alleliche tra popolazioni diverse. E' un valore che varia da 0 = nessuna differenza a 1 = massima differenza. E' considerata una delle possibili misure di pressione selettiva

iHS Haplotype A Haplotype B Haplotype C Haplotype D Recent Positive Selection

iHS The test begins with the EHH (extended haplotype homozygosity) statistic proposed by Sabeti et al.. The EHH measures the decay of identity, as a function of distance, of haplotypes that carry a specified “core” allele at one end. For each allele, haplotype homozygosity starts at 1, and decays to 0 with increasing distance from the core site in plots of EHH versus distance, the area under the EHH curve will usually be much greater for a selected allele than for a neutral allele. This integrated EHH (iHH) (summed over both directions away from the core SNP) will be denoted iHHA or iHHD, depending on whether it is computed with respect to the ancestral or derived core allele. When the rate of EHH decay is similar on the ancestral and derived alleles, iHHA/iHHD ≈ 1, and hence the unstandardized iHS is ≈ 0 Since in neutral models, low frequency alleles are generally younger and are associated with longer haplotypes than higher frequency alleles, we adjust the unstandardized iHS to obtain our final statistic which has mean 0 and variance 1 regardless of allele frequency at the core SNP:

Scopi del progetto Cercare segni di pressione selettiva nella specie Homo Sapiens e possibili collegamenti con le patologie umane Studio n.1 : Ricerca genome-wide di geni con segni di pressione selettiva e loro caratterizzazione Studio n.2 : Ricerca genome-wide di geni candidati ad essere sotto una specifica pressione selettiva (legata alla latitudine) e loro caratterizzazione

Scopi del progetto Cercare segni di pressione selettiva nella specie Homo Sapiens e possibili collegamenti con le patologie umane Studio n.1 : Ricerca genome-wide di geni con segni di pressione selettiva e loro caratterizzazione Studio n.2 : Ricerca genome-wide di geni candidati ad essere sotto una specifica pressione selettiva (legata alla latitudine) e loro caratterizzazione

Studio n.1 Data set Frequenze alleliche di circa 4,000,000 SNP di circa 500 individui da tre differenti gruppi etnici [HapMap Public Release #27 (merged II+III)]

Metodi Dati addizionali sulle SNP (posizione fisica, associazione SNP- gene furono ottenuti da dbSNP (build 129) I dati di HAPMAP e dbSNP furono fusi in un database locale MySQL attraverso un set di script Perl Furono escluse dall'analisi SNP che fossero risultate non campionate o non polimorfiche in tutte le tre popolazioni. Furono inoltre escluse le SNP con una frequenza dell'allele minore < 5% in tutti le tre popolazioni. Dopo tale selezione il campione conteneva 2.125.440 SNP Il calcolo dell'Fst fu effettuato con uno script utilizzando la formula di Wright (con correzione di Weir per la numerosità) Per assegnare un valore di Fst ad un determinato gene fu usato il massimo valore trovato tra le SNP associate a quel gene

Distribuzione dei valori di Fst da noi calcolati lungo i cromosomi

Il segnale non è distribuito in maniera randomiana. Autocorrelazione L'autocorrelazione è stata calcolata per ogni cromosoma, per ogni coppia di SNP separate da un fissato numero di SNP intermedie. La linea nera mostra il valore medio (+ 2 SE) delle correlazioni sugli autosomi. La linea rossa mostra le correlazioni delle SNP sul cromosoma X Risultato: Il segnale non è distribuito in maniera randomiana. Ljung-Box test p < 10 - 16

Distribuzione Fst tra i cromosomi Per ogni cromosoma è mostrato il box-plot dei valori di Fst. Il rettangolo è delimitato dal primo e dal terzo quartile e diviso al suo interno dalla mediana. I segmenti (i "baffi") sono delimitati dal minimo e dal massimo dei valori. Gli estremi dell'incisura rappresentano il 95% di intervallo di confidenza della mediana. Risultato I valori di Fst sono distribuiti differentemente tra gli autosomi e gli eterocromosomi (p < 10-16)

Commento La differenza tra eterocromosomi e autosomi potrebbe essere dovuta a: Campione effettivo di popolazione più piccolo (¾ per X e ¼ per Y rispetto agli autosomi) Diversa frequenza di ricombinazione Diversa pressione selettiva tra maschi e femmine

Comparazione con altre misure di pressione selettiva: Dn/Ds ratio Esistono altri metodi per studiare la pressione selettiva Alcuni di essi si basano sull'analisi comparativa di differenti specie (misura interspecie) Il metodo Dn/Ds valuta il rapporto tra mutazioni sinonime e non sinonime Un rapporto alto indica selezione positiva

Variabilità intraspecie (Fst) vs Variabilità interspecie (Dn/Ds) I geni sono stati raggruppati in accordo con l'evidenza di selezione positiva nell'analisi di 6 specie di mammifero (Kosiol et al. 2008 Plos Genetics). Le barre verticali rappresentano il 95% di intervallo di confidenza) Risultato I geni con segni di pressione selettiva interspecie (Dn/Ds > 1) mostrano un valori medi di Fst significativamente più bassi (p < 0.001)

Gene Set Enrichment Analysis GSEA L'idea chiave di GSEA è quella di valutare l'arrichhimento di una lista di geni non attraverso la valutazione di singoli geni outliers ma attraverso quella di set di geni funzionalmente collegati Dal punto di vista statistico GSEA limita i danni della correzione da test multiplo GSEA è usata comunemente nell'analisi di array. Per la prima volta ne abbiamo proposto un uso per l'analisi della funzione dei geni in base al loro valore di Fst

Pathways (KEGG ) arricchite per geni con valori di Fst statisticamente diversi dalla media Pathways arricchite per geni con alto FST Axon guidance (FDR<0.001) Focal adhesion (FDR 0.008) ECM receptor interaction (FDR 0.009) Regulation of actin cytoskeleton (FDR 0.010) Adherens junction (FDR 0.010) Calcium signaling pathway (FDR 0.010) Pathways arricchite per geni con basso FST Antigen processing and presentation (FDR 0.001)

Fst e malattie complesse Geni trovati positivamente associati con malattie complesse in accordo col Genetic Association Database, furono paragonati ai restanti. Le barre verticali rappresentano il 95% di intervallo di confidenza. Risultato I geni che sono stati associati in precedenti studi con malattie complesse mostravano mediamente un valore di Fst più alto dei restanti (p < 0.001, empirical p 0.0005).

Fst per classi di malattie

Scopi del progetto Cercare segni di pressione selettiva nella specie Homo Sapiens e possibili collegamenti con le patologie umane Studio n.1 : Ricerca genome-wide di geni con segni di pressione selettiva e loro caratterizzazione Studio n.2 : Ricerca genome-wide di geni candidati ad essere sotto una specifica pressione selettiva (legata alla latitudine) e loro caratterizzazione

Perchè latitudine: Out of Africa

Effetti legati alla latitudine Cosa cambia Adattamenti noti Colore della pelle Statura, dimensioni e forma del corpo Alcune caratteristiche dello splancnocranio (ad esempio larghezza delle narici) Esposizione ai raggi solari (quantità e ritmo) Clima e temperatura Risorse alimentari

Sole, vitamina D, rachitismo

Vitamina D

Il colore della pelle

Principali malattie umane riportate in letteratura come legate alla latitudine Cancro (296) Ipertensione (50) Malattie del SNC (Parkinson, Alzheimer, Schizofrenia, Sclerosi multipla) (164) Diabete tipo 1 (60)

Prevalenza cancro

Studio n.2 Data set Frequenze alleliche di 660.918 SNP di 1043 individui da 52 differenti gruppi etnici [HGDP-CEPH HUMAN GENOME DIVERSITY PANEL]

Costruzione di una lista di geni con alto Fst e con alta correlazione con la latitudine 10% 10% Alto Alta Latitude Related Genes (LRG) Fst Correlazione con latitudine Lista arricchita per geni sotto probabile pressione selettiva (alto Fst) latitudine dipendente (alta correlazione) Basso Bassa

Risultati: Localizzazione tissutale Latitude Related Genes (LRG) Tissue Genes LRG count (%) p-value* Brain 683 (56.6%) 3E-18 Amygdala 112 (9.3%) 8E-6 Thalamus 76 (6.3%) 1.4E-4

Risultati: classi funzionali (Gene Ontology) Latitude Related Genes (LRG) Name Sub Ontology Marginal mean (Min-Max) Genes LRG count Total Count Synapse (GO:0045202) CC 0.998 (0.980 - 1) 60 351 Neuropetide signaling pathway (GO:0007218) BP 0.793 (0.764 – 0.828) 13 86 Cell morphogenesis (GO:0000902) 0.734 (0.680 – 0.789) 58 420

Confronto con patologie del SNC con frequenza latitudine dipendente Parkinson genes Latitude Related Genes (LRG) Alzheimer genes Schizophrenia genes Multiple sclerosis genes

Malattie del SNC Latitude Related Genes (LRG) Schizophrenia genes Disease Overlap with genes LRG Total count P-value Adjusted p-value Schizophrenia 85 885 4E-6 1.6E-5 Parkinson's disease 40 490 0.021 0.084 Multiple sclerosis 16 178 0.058 0.232 Alzheimer's disease 45 618 0.075 0.3

Schizofrenia Serio disordine mentale caratterizzato da deliri, allucinazioni, disordine del pensiero, affettività inappropriata o appiattita, anedonia (incapacità a provare piacere) e ritiro sociale Malattia multifattoriale ed eterogenea Prevalenza 0.5-1% della popolazione mondiale John Forbes Nash Premio Nobel Economia 1994 e schizofrenico

Componente ereditaria della schizofrenia

Dimensioni dei ventricoli

Dimensione ippocampo ed amigdala Ippocampo ed amigdala sono più piccoli nei pazienti I corpi cellulari dell'ippocampo sembrano disorganizzati Paziente Controllo

Perchè potrebbe esistere un adattamento evolutivo che coinvolge il rischio di sviluppare una malattia come la schizofrenia ? ?

Perchè potrebbe esistere un adattamento evolutivo che coinvolge il rischio di sviluppare una malattia come la schizofrenia ? Vitamina D

La vitamina D influenza lo sviluppo del cervello

Costruzione di una lista di geni correlati alla vitamina D Vitamin D (calciferol) metabolism” Reactome (REACT_13523.2) Vitamin D related genes (943) Biocarta's pathway “Control of the expression by vitamin D receptor” Microarray data: Genes differentially expressed in SCC25 cells treated with 1,25(OH)2D3

I geni correlati alla latitudine sono arricchiti per geni della pathway della vitamina D Latitude Related Genes (LRG) Questo dato suggerirebbe, per la prima volta, la presenza di fenomeni di adattamento alla carenza di vitamina D non collegati alla classica variazione della pigmentazione cutanea Vitamin D related genes (943) 97 geni p = 3.5 x 10-8

Uno dei nove:SMARCA2 SMARCA2

Cosa fa SMARCA2 ? E' una della ATPasi del complesso SWI/SNF Regolazione ciclo cellulare Differenziazione Regolazione della trascrizione Cancro Immunità Il complesso SWI/SNF nei mammiferi si presenta come una serie di possibili differenti assemblaggi composti da subunità alternative In particolare i complessi possono contenere una delle due forme di ATPasi: Brahma (BRM/SMARCA2) o Brahma- related gene (BRG1)

Che c'entra il complesso SWI/SNF con la Vitamina D ? Il complesso SWI/SNF si complessa a sua volta con subunità legate alla duplicazione del DNA (TopoII, CAF-1p150) e fattori di elongazione ((FACTP140) per formare un complesso chiamato WINAC WINAC ed il recettore della vitamina D sono trasportati verso i promotori regolati (sia negativamente che positivamente) in assenza di ligando. WINAC riarrangia i nucleosomi facilitando l'accesso a complessi di coregolazione (attivati dal ligando) per un ulteriore controllo della trascrizione

Che c'entra SMARCA2 con la schizofrenia ? Il polimorfismo rs3793490 di SMARCA2 (che è lo stesso polimorfismo che noi troviamo correlato alla latitudine) modifica il rischio di schizofrenia In particolare l'allele T aumenta il rischio di sviluppare la malattia (Odds ratio (95% CI) = 1.25 (1.14-1.38))

Allele che aumenta il rischio di schizofrenia

SMARCA2 rs3793490 Individui che veicolano l'allele T di rs3793490 mostrano livelli di mRNA di SMARCA2 ridotti Human Molecular Genetics, 2009, Vol. 18, No. 13

La diminuzione di SMARCA2 ha differenti effetti in differenti tessuti Cellule silenziate Accellerata “rate” di mineralizzazione Maggiore espressione di marker osteogenici Animali knock-out Dimensione del corpo maggiore (14% del normale) Aumento spoporzionato delle ossa e dei muscoli Pazienti Ridotta espressione dimostrata in corteccia prefontale di pazienti schizofrenici Animali knock-out Ridotta interazione sociale e presenza di “prepulse inhibition” Farmacologia Farmaci che determinano psicosi abbassano SMARCA2 Farmaci antipsicotici aumentano SMARCA2

Modello Variante G fa più SMARCA2 Variante T fa meno SMARCA2 resiste meglio al rachitismo Variante T fa meno SMARCA2 aumentato rischio schizofrenia

Antonella Monticelli Roberto Amato Michele Pinelli Rino Miele Gruppo Interdipartimentale Bioinformatica e Biologia Computazionale Michele Pinelli Rino Miele

Un altro aspetto curioso della teoria dell'evoluzione è che tutti pensano di capirla! (Jacques Monod) …. persino i genetisti (anonimo)

The end