IDENTIFICAZIONE: l’approccio tradizionale

Identificazione convenzionale Test biochimici Test colturali

Test biochimici Accumulo di niacina Riduzione dei nitrati Catalasi semiquantitativa Idrolisi del Tween 80 Ureasi Riduzione del tellurito Arilsolfatasi β-glucosidasi

Niacina Prodotto del metabolismo micobatterico accumulato nel terreno requisiti della coltura l’estrazione la rivelazione 24 ore Distingue il M. tuberculosis dalle altre specie Irregolarmente positiva nel M. simiae Raramente positiva in altri micobatteri

Nitrati Svariate specie micobatteriche sono in grado di ridurre i nitrati a nitriti 4 ore

Catalasi a 68°C Praticamente tutti i micobatteri producono catalasi In quasi tutte le specie, ad eccezione di quelle del M. tuberculosis complex la catalasi è termoresistente incubazione a 68°C per 20 min rivelazione con H2O2 20 min

Catalasi semiquantitativa I diversi tipi di catalasi prodotti dalle varie specie micobatteriche differiscono anche quantitativamente Il test permette di differenziare i ceppi che, in seguito all’aggiunta di H2O2, producono una colonna di bollicine superiore, o inferiore, a 45 mm 14 giorni

Idrolisi del Tween 80 Alcuni micobatteri possiedono una esterasi, grazie ad essa sono in grado di idrolizzare il Tween 80 Utilizzando Tween legato a rosso neutro, l’idrolisi è evidenziata dal viraggio al rosso 10 giorni

Ureasi Alcuni micobatteri sono in grado di idrolizzare l’urea L’avvenuta idrolisi è indicata dal viraggio di un idoneo indicatore 3 giorni

Riduzione del tellurito La capacità di ridurre il tellurito di potassio a tellurio metallico si evidenzia dalla formazione di un precipitato nero 10 giorni

Arilsolfatasi I micobatteri provvisti di arilsolfatasi sono in grado di idrolizzare la fenolftaleina tripotassica a fenolftaleina La fenolftaleina, in ambiente alcalino, sviluppa un colore rosso 3 giorni

β-glucosidasi I micobatteri che possiedono la β‑glucosidasi sono in grado di idrolizzare i β‑glucosidi liberando glucosio Usando come substrato il p‑nitrofenil‑D‑glucoside si ha liberazione di p‑nitrofenolo che è giallo 3 ore

Test colturali Velocità di crescita Temperature di crescita Pigmento Morfologia delle colonie Test di inibizione selettiva

Velocità di crescita I micobatteri a crescita rapida formano colonie visibili ad occhio nudo in meno di una settimana I micobatteri a crescita lenta possono richiedere anche 6 settimane Il tempo richiesto per la crescita nella coltura primaria non è indicativo Il tempo richiesto per la crescita in coltura liquida non è indicativo Il test deve essere eseguito utilizzando un inoculo diluito

Temperature di crescita Il range di temperatura che permettono lo sviluppo delle varie specie batteriche è ampio Oltre all’incubazione a 37°C è necessario provare almeno altre due temperature, 25-30°C e 42‑45°C

I micobatteri si distinguono in: Pigmento I micobatteri si distinguono in: non cromogeni scotocromogeni fotocromogeni

Morfologia delle colonie Aspetto macroscopico Aspetto microscopico (100x)

Test di inibizione selettiva L’aggiunta al terreno di particolari sostanze permette di distinguere le specie che ne tollerano la presenza, che crescono, da quelle che ne risultano inibite TCH NaCl Tiacetazone Idrossilamina (MacConkey) NAP

Identificazione Confronto dei risultati dei test con i dati presenti in letteratura (tabelle)

Identificazione

Impiego attuale Identificazione del M. tuberculosis Niacina + nitrati Identificazione dei MOTT Ampio pannello di test Supporto ad altri approcci identificativi Test mirati Velocità di crescita Pigmento Temperature di crescita

Conclusioni Non esistono kit commerciali I tempi sono estremamente lunghi Non tutti i test sono perfettamente riproducibili L’affidabilità delle identificazioni è buona solo per le specie più comuni Non permettono di riconoscere i micobatteri rari o “nuovi” Alcuni test possono essere utilizzati per dirimere ambiguità emergenti da altri sistemi di identificazione Permettono di differenziare le specie all’interno del M. tuberculosis complex