Laurea in Medicina e Chirurgia Anno accademico 2011-2012 Biochimica/biologia molecolare clinica e diabete Prof. Fabrizio Barbetti

Il diabete mellito Definizione e tipi di diabete mellito. Cenni sul controllo fisiologico dei livelli ematici del glucosio. Ia biochimica clinica nella diagnosi del diabete mellito. Il diabete monogenico e la sua diagnostica La biochimica clinica nel controllo metabolico e nella valutazione delle complicanze

Definizione di diabete mellito “Un gruppo di disordini metabolici eterogenei dal punto di vista clinico e genetico caratterizzati da elevati livelli ematici di GLUCOSIO” Nella classificazione corrente si distinguono due tipi principali di diabete: il tipo 1 (T1D, distruzione immuno-mediata delle cellule  pancreatiche). il tipo 2 (T2D, conbinazione di “insulino resistenza” e deficit insulinico risultanti sia da fattori genetici che ambientali). T1D + T2D: >95% dei casi

Il controllo fisiologico dei livelli ematici del glucosio Il glucosio ematico è regolato entro limiti stretti. Il controllo fisiologico della glicemia è -tra l’altro- finalizzato al mantenimento di livelli minimi di glucosio durante la fase di digiuno notturna. H-C=O H-C-OH 3 OH-C-H CH2OH D-Glucosio

+ + + + Glicemia  Isola pancreatica 70 mg/dl 120   Glucagone Somatostatina Glicemia  Isola pancreatica 70 mg/dl 120   + Glucagone Insulina Glucosio + + + Uptake del gluocosio Glicolisi Gluconeogenesi Glicogenolisi Lipogenesi Uptake del glucosio MUSCOLO SCHELETRICO FEGATO TESSUTO ADIPOSO

+ + + + Glicemia  Isola pancreatica 400 mg/dl 600   Glucagone Somatostatina Glicemia  Isola pancreatica 400 mg/dl 600   + Glucagone Insulina Glucosio 2+ + + + Uptake del gluocosio Glicolisi Gluconeogenesi Glicogenolisi Lipogenesi Uptake del glucosio MUSCOLO SCHELETRICO FEGATO TESSUTO ADIPOSO

La “soglia” renale I livelli plasmatici di glicemia raggiunti i quali si “satura” il meccanismo di riassorbimento del glucosio a livello del tubulo renale: mediamente attorno a 180 mg/dl. Primo dosaggio affidabile della glicemia su sangue intero: Folin-Wu (1920). Primi inibitori della glicolisi: 1931.

I primordi della biochimica clinica: il “dosaggio” ( I primordi della biochimica clinica: il “dosaggio” (!?!) della glicosuria nella diagnosi di diabete Diagnosi rara nell’ ‘800: su circa 48.000 ricoveri al Massachussets General Hospital tra il 1824-1898, solo in 172 casi (0,004%) venne emessa diagnosi di diabete. Metodo analitico: far assaggiare al medico interno le urine del paziente.

Dosaggio della glicemia: raccolta e conservazione del campione Il dosaggio del glucosio in laboratorio è effettuato su siero o plasma (il sangue intero è utilizzato nell’autocontrollo domiciliare e fornisce valori più bassi del 12-15%). Poiché la glicolisi diminuisce la concetrazione di glucosio ad un tasso del 5-7%/h a temperatura ambiente, si aggiungono al prelievo inibitori della glicolisi come il sodio fluoruro (NaF), in grado di stabilizzare i livelli di glucosio per almeno 3 giorni a temperatura ambiente ed un anticoagulante (ossalato di potassio).

Diabete tipo 2: rilevanza della diagnosi T2D= circa 90% di tutti i casi. Insorge tipicamente > 50 anni di età ed ha una elevata morbidità e costo sociale. L’aumento della prevalenza di T2D correla con l’aumento dell’obesità. 30-35% degli individui con T2D sono asintomatici ed inconsapevoli della malattia. L’iperglicemia asintomatica può precedere di molti anni (fino a 10) l’esordio clinico e correla con il rischio cardiovascolare. Una significativa percentuale di pazienti con T2D (ca. 20% negli USA) presenta retinopatia diabetica alla diagnosi.

Le complicanze alla diagnosi come indicatore di malattia silente: la retinopatia La retinopatia diabetica può essere presente alla diagnosi e correla con gli anni di malattia. Estrapolando i dati è evidente che il diabete tipo 2 può essere presente almeno 6.5 anni prima dei sintomi clinici (e oltre !).

Diabetes (): “passare attraverso” 1964: il WHO stabilisce/propone i primi criteri diagnostici mediante il carico orale di “tolleranza” GLUCOSIO (OGTT). In Giappone: “Shoukachi” ovvero malattia della sete. Primi del ‘900: test di “tolleranza” al RISO

Carico orale di glucosio (OGTT): modalità. OGTT “standard”: 75 g di glucosio (disciolto) per os e prelievi al tempo 0’ ed ogni 30’ per 2 ore. Da effettuarsi solo se la glicemia a digiuno NON abbia già valore diagnostico. Casi speciali. Screening del diabete gestazionale: minitest (50 g), prelievi a 0’ e 60’. Se >140 mg/dl a 60’, OGTT con 100 g. Bambini < 40 Kg: 1.75g per Kg di peso corporeo.

Diabete mellito: criteri diagnostici ADA* e WHO § Criteri ADA*/WHO§ Sintomi classici di diabete e un valore di glicemia venosa plasmatica “casuale” =/> a 200 mg/dl (*, §). Glicemia a digiuno >126 mg/dl (per 2 volte) (*, §). Glicemia =/>200 mg/dl al tempo 120’ dell’OGTT (§, [*]). Categorie a rischio: IGT (alterata tolleranza al glucosio): coloro che hanno una glicemia plasmatica a 120’ dell’OGTT >140 e <200 mg/dl (§, [*]). IFG (alterata glicemia a digiuno): coloro che hanno una glicemia a digiuno >100** e <126 mg/dl (*). ** RIVISTO NEL 2003 (precedente >110)

Criterio di scelta della glicemia a digiuno diagnostica di diabete da parte degli esperti ADA Il valore di 126 mg/dl è stato scelto come “equivalente” in termini di sensibilità e specificità al valore di 200 mg/dl a 120’ dell’OGTT.

Uso o non uso dell’OGTT nella diagnosi di diabete: conseguenze pratiche

Cambiamento di prevalenza: non solo un problema metodologico Boston, 1946. Campione: circa 70.000 persone. USA 2000 (stima WHO): 17.700.000 Messico 2000 (stima WHO): 2.179.000 Italia 2000 (stima WHO): 4.252.000 Prevalenza diabete: 0.52 % USA 2030 (stima WHO: 30.3120.000 Messico 2030 (stima WHO): 6.130.000 Italia 2030 (stima WHO): 5.374.000

Il diabete tipo 1 Il T1D è una malattia autoimmune organo specifica caratterizzata dalla distruzione delle cellule beta pancreatiche mediata dai linfociti T. Esordisce tra l’infanzia e la pubertà, ma nessuna età è risparmiata. L’esordio clinico è spesso brusco, con forte dimagramento, poliuria, iperglicemia elevata accompagnata da chetosi.

Gli autoanticorpi circolanti confermano la diagnosi clinica Islet Cell Antibodies (ICA) Glutamic Acid Decarboxylase Antib. (GADA) Insulinoma-associated protein 2 Antib. (IA-2A) Insulin autoantibodies (IAA) ZnT8 autoantibodies (ZnT8A)

Ruolo degli autoanticorpi per la predizione del T1D Il dosaggio degli autoanticorpi nei parenti di primo grado di soggetti con T1D combinato con la valutazione delle secrezione insulinica è un valido predittore di insorgenza di T1D. Circa il 3-5% dei pazienti clinicamente T1D sono negativi al dosaggio degli autoanticorpi.

Elevata percentuale di malattia celiaca nei pazienti con T1D 6.8-8.3 % dei pazienti con T1D hanno la malattia celiaca, confermata con biopsia intestinale. Di questi, circa il 70% sono sintomatici. IgA antiendomisio (EmA) o anti-TG2 (sensib.>90%, spec.>95% Se IgA tot. <5 g/L-> IgG antigliadina (AGA)

GENETICA del T1D e T2D Entrambe malattie poligeniche (nessun andamento di tipo mendeliano) Geni maggiori del T1D: 1) HLA; 2) VNTR del gene INS Geni maggiori del T2D: polimorfismi del gene TCF7L2, moltissimi altri

La famiglia “GCK/MODY 2” Glic.= 143 Età= 65 anni “Scoperta” = 39 aa Terapia=Dieta Complicanze=NO Glic.= 132 Età= 31 anni “Scoperta”= 24 aa Terap.=Dieta = Normale Glicemia= 118 Età= 6 anni Glicemia= 130 Età= 3 anni = mutazione GCK

Le mutazioni GCK/MODY 2 (1) Il gene della glucochinasi (GCK) è uno dei sette geni noti che causano un sottotipo monogenico di diabete mellito denominato MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young). Il MODY si definisce come una condizione autosomica dominante in cui il diabete -non di tipo 1- insorge prima dei 25 anni di età.

2 2

Le mutazioni GCK/MODY 2 (2) Le mutazioni della glucochinasi sono relativamente frequenti quando ricercate in una casistica pediatrica. L’iperglicemia è modesta e NON progredisce nel tempo. La diagnosi molecolare derime i dubbi nei famigliari del bambino portatore ed è utile per l’indirizzo terapeutico e della valutazione delle complicanze.

Il diabete tipo 1: un esempio clinico. Bambino di 14 anni con recente perdita di peso, poliuria, polidipsia, alito acetonico Glicemia a digiuno: 318 mg/dl Chetoni nelle urine: presenti (Ketostix +++, semiquantitativo= 80-100 mg/dl) Diagnosi clinica: diabete tipo 1. E’ una diagnosi corretta ?

Il dosaggio degli autoanticorpi nel sospetto clinico di T1D in soggetti ad elevata familiarità ICA Decarbossilasi dell’acido glutamico (GAD65) Islet antigen 2 (IA-2) Insulina (IAA) Ab - probabile MODY3/HNF 1 = Diabete mellito ad esordio precoce (<40 anni) Ab + T1D = Sospetto T1D

Mutazioni MODY 3/HNF-1: possibili meccanismi di iperglicemia Topo HNF-1 -/-. Ridotta espressione genica nella cellula  di: 1) Ins-1 (ma non Ins-2) 2) Glut 2, GK 3) Ipf-1/Pdx-1 4) NeuroD, HNF-4

Efficacia delle solfaniluree nei paz. MODY 3 Deterioramento della HbA1c-> 10.3% dopo cambio per metformina Perdita di peso - 5.3kg Ripristinata Glibenclamide 5mg HbA1c 5.3% Pearson et al. Diab Med 2000

Casi sporadici con insorgenza nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ? Neonato che alla terza giornata di vita esordisce con glicemia 400 mg/dl, chetoacidosi Peso alla nascita: 2.400 g Familiarità per diabete: nessuna

KATP channels and insulin secretion regulation KCOs sulphonylureas KATP channel activity Ca2+ SUR1 KATP dependent or triggering pathway produce 1st phase insulin release depolarize VDCC KIR6.2 + _ K+ metabolism [Ca2+]i Glucose ATP/ADP + + KATP independent or augmentation pathway - prolonged 2nd phase insulin release Cav2.3 pulsatile insulin release

Insulin weaning and transfer to SU in patients with KCNJ11 mutation Age at “switch” Dose mg/kg/d HbA1c TX: Ins TX: SU Dur. TX SU C-peptide nmol/L R50P 10a, 6m 0.57 7.2 6.3 10m 0.23 V59M 17m 0.5 9.8 5.2 7m 0.2 28m 0.39 9.2 5.8 14m 0.3 9a, 1m 0.18 8.0 5.4 12m R201C 22m 0.32 7.3 6.7 0.12 R201H 6m 0.47 6.4 2m 0.2* 0.37 7.9 4.9 4m 23m 0.16 7.1 5.5 1m 0.7* 9a 0.55 7.7 0.06 K170R 8a, 6m 0.61 8.4 7.4 0.21 mean 5.9 Tonini,…Barbetti, Diabetologia 2006

Casi sporadici e non con insorgenza nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ? Neonato che al terzo mese di vita esordisce con glicemia 500 mg/dl, chetoacidosi Peso alla nascita: 3.100 g Familiarità per diabete: un genitore con diabete diagnosticato entro i primi due anni di vita

Insulin precursor Signal peptide A-chain B-chain C-peptide M A L W M R NH2 M A L W M R L L P L Signal peptide 3 2 1 L 4 N V F A A A P D P G W L A L L A E 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 H 5 L C G S H L V E A L Y L V C G E R 23 G s=s s=s F 24 5 C E C C T S I S L Y Q L N Y C N COOH Q 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 F 25 s=s 4 A-chain E PC-2 26 Y 3 V P T 27 I 2 G H R K Q L S 28 1 P L G B-chain K 29 E Insulin precursor L Q P L A L S T 30 G R A R G P G G G L E V Q G V E L D E A E C-peptide

WT (PRO)INSULIN

R65C (PRO)INSULIN

nd-PS/1: C-peptide values 70, 90, 150 and 350 days after discovery of hyperglycemia

Gli “old-days” della biochimica clinica nel controllo metabolico: la “soglia” renale I livelli plasmatici di glicemia raggiunti i quali si “satura” il meccanismo di riassorbimento del glucosio a livello del tubulo renale: mediamente attorno a 180 mg/dl.

Rilevanza della HbA1c come marcatore di rischio delle complicanze microvascolari DCCT (T1D): -35% del rischio di progressione della retinopatia diabetica ad ogni decremento del 10% (ad es. da 8 a 7.2%) della HbA1c UKPDS (T2D): -35% di rischio di progressione delle complicanze microvascolari ogni decremento di 1 punto percentuale (ad es. da 9 a 8%) della HbA1c

“Biotecnologia di ritorno”: l’uso della HbA1c a fini diagnostici (2009) HbA1c> 6.5%=diabete Vantaggi: modeste variazioni intraassay, nessuna necessità di digiuno, stabile a RT Svantaggi: risultati spuri in caso di condizioni che influenzano la vita media dei globuli rossi.

La nefropatia diabetica Insorge nel 35-45% dei casi con T1D Insorge nel 20-35% dei casi con T2D 1a causa di insufficienza renale e trattamento dialitico. Insorge solitamente dopo 15-20 anni di malattia, ma può essere più precoce. Se accertata nelle sue prime fasi, può regredire Marcatore precoce la “microalbuminuria”

Il ruolo della biochimica clinica nella valutazione della nefropatia diabetica. L’aumento di escrezione urinaria di albumina (UAE) è un marcatore di alterazione microvascolare. 2) Una UAE aumentata è -a volte- presente nei pazienti con diabete tipo 2 alla diagnosi. 3) UAE > 20 g/min è un fattore di rischio di sviluppare una nefropatia diabetica clinicamente evidente. 4) UAE nei soggetti con diabete tipo 2 è un predittore indipendente di aterosclerosi e mortalità cardiovascolare.

Microalbuminuria: definizione Valori compresi tra 30 e 300 mg/24 ore La terminologia NON si riferisce ad una isoforma particolare di albumina, ma al fatto che i livelli di UAE non sono rilevabili dai comuni metodi colorimetrici con “stick” (in grado di misurare concentrazioni >200 mg/L), pur essendo i valori al di sopra della norma (<30 mg/24 ore).

Microalbuminuria: quando, come. Nei soggetti con T1D a partire da 5 anni dalla insorgenza della malattia. Controlli successivi con cadenza annuale. Nei soggetti con T2D alla diagnosi e successivamente con cadenza annuale. Metodi quantitativi: Dosaggio radioimmunologico. Sensibile e preciso. ELISA (“sandwich”).

Microalbuminuria: problemi La UAE aumenta con: l’esercizio fisico l’ipertensione arteriosa la posizione eretta l’iperglicemia -> necessità di standardizzare la raccolta del campione.