The Journal of Biological Chemistry, published on September 25th, 2009 as Manuscript The macrophage cholesterol exporter ABCA1 functions as an anti-inflammatory receptor Chongren Tang, Yuhua Liu, Peter S.Kessler, Ashley M.Vaughan and John F.Oram Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of Medicine, University of Washington, Seattle.

è una proteina integrale di membrana, responsabile dell’efflusso ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) è una proteina integrale di membrana, responsabile dell’efflusso del colesterolo dalle cellule e… ...espleta un’azione immunomodulante!!!

Funzione e trasporto del colesterolo Struttura e regolazione dell’espressione di ABCA1 Receptor-like activity and lipid transport model

Il colesterolo è un metabolita abbondante nei tessuti dei mammiferi,essenziale per parecchie funzioni biologiche. Esteri del colesterolo ACAT Fluidità di membrana Precursore Vitamina D Lipid rafts Acidi Biliari Ormoni steroidei: -Mineralcorticoidi, -Glucocorticoidi, -Ormoni sessuali

8 1 6c 6a 6b 4 5 2 7 6 3

Le lipoproteine sono formate da : 1) apoproteine (alfa-elica amfipatica) 2) fosfolipidi 3) trigliceridi 4) colesterolo libero ed esterificato 5) acidi grassi liberi

Classificazione delle Lipoproteine 1-2 7-10 10-12 20-22 30-35 55-77 99

LDL  Le LDL sono il principale trasportatore di colesterolo ai tessuti. L'uptake delle LDL avviene per via recettoriale al fegato (75/%), corteccia surrenale e tessuto adiposo e MACROFAGI.

5 1 3b 2 4a 4b 3a

Immagine in TEM dell’endocitosi Mediata da recettore delle LDL

Core di esteri del colesterolo HDL A subfraction of circulating lipoproteins called high-density lipoproteins (HDLs) is involved in the export of excess cholesterol from cells Core di esteri del colesterolo Una delle maggiori funzioni delle HDL è il trasporto del colesterolo dai tessuti periferici al fegato, dove esso viene escreto nella bile. Si ritiene che la rimozione dell’eccesso di colesterolo dai macrofagi del connettivo vascolare da parte delle HDL abbia un ormai ben stabilito effetto cardioprotettivo.

Sono stati identificati tre trasportatori di membrana che mediano l’efflusso del colesterolo dalle cellule alle componenti delle HDL. Essi appartengono alla superfamiglia “ ATP-binding cassette transporters (ABCs) “[trasportatori di membrana ATP-dipendenti]: ABCA1 trasporto di colesterolo, fosfolipidi ed altri metaboliti alle apoproteine delle HDL; è altamente espresso in fegato e macrofagi tissutali; ABCG1 e ABCG4trasporto del colesterolo a HDL e altre lipoproteine; ABCG1 è anch’esso espresso nei macrofagi e lavora in sinergia con ABCA1 nel rimuovere il colesterolo in eccesso. ABCG4 è selettivamente espresso nei neuroni dove è specializzato nel trasporto lipidico

Funzione e trasporto del colesterolo Struttura e regolazione dell’espressione di ABCA1 Receptor-like activity and lipid transport model

ABCA1 WalkerA WalkerC NBD2 NBD1 WalkerB

Substrati Accettori Fosfolipidi (fosfatidilcolina) Colesterolo Apolipoproteine di HDL: A-I, A-II, E, C-I, C-II, C-III, A-IV PLTP: phospholipid-transfer-protein Proteine contenenti alfa-eliche anfipatiche (11,22aa),in cui gli aa carichi si dispongono lungo una faccia dell’asse,gli aa idrofobici sulla faccia opposta! Fosfolipidi (fosfatidilcolina) Colesterolo

Cytogenetic location: 9q31.1 The cellular transporter ABCA1 is a critical protein that transports excess free cholesterol (FC) out of the cell to an acceptor, lipid-poor apo A-I. ABCA1 gene transcription is regulated by the nuclear receptor heterodimer liver X receptor/retinoid X receptor (LXR/RXR). Cellular oxysterols appear to be one of the endogenous ligands for LXR and promote the transcription of ABCA1. Oxysterols are generated from free cholesterol. Presumably, this represents a homeostatic mechanism by which macrophages rid themselves of excess free cholesterol. LXR gene transcription is also influenced by both peroxisome proliferator-activated receptor  (PPAR-) and PPAR-

PPARs A-I oxysterols LXR/RXR ABCA1 Regulation of cholesterol efflux in the macrophage A great deal has been learned about the regulation of cholesterol efflux in the macrophage. The cellular transporter ABCA1 is a critical protein that transports excess free cholesterol (FC) out of the cell to an acceptor, lipid-poor apo A-I. ABCA1 gene transcription is regulated by the nuclear receptor heterodimer liver X receptor/retinoid X receptor (LXR/RXR). Cellular oxysterols appear to be one of the endogenous ligands for LXR and promote the transcription of ABCA1. Oxysterols are generated from free cholesterol. Presumably, this represents a homeostatic mechanism by which macrophages rid themselves of excess free cholesterol. LXR gene transcription is also influenced by both peroxisome proliferator-activated receptor  (PPAR-) and PPAR-. LXR/RXR ABCA1

Funzione e trasporto del colesterolo Struttura e regolazione dell’espressione di ABCA1 Receptor-like activity and lipid transport model

Receptor-like activity ABCA1 is unique among eukaryotic ABC transporters that requires the direct binding of the acceptor for the transported substrate.The ABCA1 binding determinant of apolipoproteins is the amphipatic α-helix.This binding may be mediated by the large extracellular loops of ABCA1,which are unique for this family of transporters.

(FEEDFORWARD MECHANISM) The interaction of apolipoproteins with ABCA1-expressing cells also activates signaling molecules that modulate ABCA1 expression or lipid transport activity:these findings suggest that apolipoprotein/ABCA1 interactions behave like a ligand/receptor system.In fact, this interaction stimulates autophosphorylation of tyrosine kinase Jak2,thus generating the active Jak2:apo A-I potentiates its own interaction with ABCA1 by activating Jak2,which in turn increases the apo A-I binding to ABCA1 required for lipid removal RECEPTOR ACTIVITY (FEEDFORWARD MECHANISM)

LIPID TRANSPORT MODEL Chamber P ATP ADP

2 5 3 4 HDL (A)Phospholipids and perhaps free cholesterol ( C ) are translocated across the plasma membrane to form tightly packed and disordered lipid domains that protrude from the cells. (B) Apo A-I binds to ABCA1 and stimulates phosphorilation of Jak2.( C ) The phosphorilated/activated Jak2 enhances the Apo A-I binding to ABCA1 required for interaction with lipid domains generated by ABCA1.(D)Apo A-I solubilizes the lipids to form nascent HDL particles.

è una proteina integrale di membrana, responsabile dell’efflusso ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) è una proteina integrale di membrana, responsabile dell’efflusso del colesterolo dalle cellule e… ...espleta un’azione immunomodulante!!!

Cholesterol uptake LDL e oxLDL Uptake di oxLDL: recettori Scavenger Signaling pathway associato a Recettori Scavenger

…Le LDL sono tutte uguali? LDL/LDL-R …Le LDL sono tutte uguali? LDL

oxLDL (LDL modificate) Danno da Radicali Liberi (ROS,RNS): -respirazione cellulare(mitocondriale) -ossidasi microsomiali -catalizzatori chimici (metalli di transizione) -prodotti di PMN (NADPH ossidasi, Mieloperossidasi) -introito alimentare di lipidi ossidati (termo-ossidazione:frittura)

Perossidazione del colesterolo

ossiSteroli Steroli LDL oxLDL Tirosina nitrotirosina Glucosio Acido linoleico (C18) Acido 9-idrossi-octadecadienoico Tirosina nitrotirosina Glucosio ossiSteroli Steroli Formazione di AGECross Links

Site of chemical modifications in in vivo LDL− and ONOO−-treated LDL The secondary structure of the apoB-100 is showed. We show the chemical modifications in LDL− and ONOO−-treated LDL.

Gli AGE sono in grado di modificare i gruppi aminici primari dei fosfolipidi e delle apo(B-100) delle lipoproteine a bassa densità (LDL). Gli AGE, inoltre, sono in grado di iniziare una serie di reazioni ossidative che promuovono la generazione di LDL ossidate.

Treatment of native LDL with ONOO- resulted in extensive tyrosine nitration , accumulation of lipid peroxides, and loss of α-helical structure and, as a corollary, formation of oxLDL: Nitrotyrosine and lipid peroxide accumulation are synergistically responsible for unfolding of α-helices inherent in LDL− formation. tyrosine nitration lipid peroxides Glucose reacts nonenzymatically with the amino groups of proteins to form stable, cross-linking adducts called advanced glycation end products or AGEs. cross-linking

Self o NON-SELF? (that’s the question!) SELF ALTERATO!!

Le LDL modificate sembra che possano essere riconosciute da recettori specifici a livello delle cellule endoteliali e dei monociti/macrofagi e sono in grado quindi di indurre modificazioni fenotipiche di tipo secretorio e proliferativo. Motilità dei macrofagi sulla parete arteriosa oxLDL Azione chemiotattica induce Pattern di espressione genica (geni della flogosi) IMMUNOGENA Citochine proinfiammatorie Molecole di adesione cellulare

come vengono internalizzate? .oo OOH ONOO- ROOH le LDL modificate (oxLDL) non vengono riconosciute dal recettore fisiologico LDL-R come vengono internalizzate?

Recettori SCAVENGER Per Recettori scavenger(=“spazzini”) s’intende un gruppo di recettori capaci di legare le LDL modificate(ossidate,acetilate). Sono prevalentemente espressi sui macrofagi(immunità innata) Modified proteins Oxidised LDL Acetylated LDL AGE-proteins Apoptotic cells’ Phosphatidyl serine Bacterial components LPS Lipoteichoic acid

They preferentially bind modified LDL by acetic acid and oxidized LDL Scavenger receptor class A: -Trimers -collagene-like domain -cysteine-rich domain Scavenger receptor class B: -two transmembrane domains -situated in specific plasma membrane microdomains, the caveolae (lipid rafts). LOX-1: lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 They preferentially bind modified LDL by acetic acid and oxidized LDL CD36

Recettore Scavenger di classe A Recettore Scavenger di classe B

Ossisteroli Oxidized fatty acid endocitosi The binding of oxidized low density lipoprotein(LDL) to CD36 is mediated in part by oxidized phospholipids that are associated with both the lipid and protein moieties of the lipoprotein.

CD36-dependent signaling pathway Proteina adattatrice Ras_GDP GTP P LYN Grb2-SoS JNK P MAPK ATP Fos P ATP Vav AP-1 Dominio di omologia CD4/CD8: CysXCysX 5lys (CXCX 5K) site of interaction with Src- tyrosine kinases Src-family nonreceptor protein tyrosine kinases fyn, lyn Jun Rac-GDP GTP P

Proteina adattatrice P LYN PLC P PKC P P IKK P IκB NF- κB

Fas IL12 MMPs (MMP1, MMP2, MMP3, MMP13) TNFα iNOS Fas MMPs CD40 IL-1 IL-6,IL-12 CCL2(MCP-1) Induzione della Flogosi Fas IL12 MMPs (MMP1, MMP2, MMP3, MMP13) Innesco dei meccanismi effettori dell’immunità innata Jun Activator Protein – 1 (AP-1) Fos P NF- κB

Induzione di un nuovo profilo trasduttivo Uptake delle oxLDL Induzione di un nuovo profilo trasduttivo LDL oxLDL CD36 Regulation of cholesterol efflux in the macrophage A great deal has been learned about the regulation of cholesterol efflux in the macrophage. The cellular transporter ABCA1 is a critical protein that transports excess free cholesterol (FC) out of the cell to an acceptor, lipid-poor apo A-I. ABCA1 gene transcription is regulated by the nuclear receptor heterodimer liver X receptor/retinoid X receptor (LXR/RXR). Cellular oxysterols appear to be one of the endogenous ligands for LXR and promote the transcription of ABCA1. Oxysterols are generated from free cholesterol. Presumably, this represents a homeostatic mechanism by which macrophages rid themselves of excess free cholesterol. LXR gene transcription is also influenced by both peroxisome proliferator-activated receptor  (PPAR-) and PPAR-. Geni della Flogosi

Macrophage response to oxidized lipid-loading: A PATHWAY FOR CHOLESTEROL EFFLUX

PPARγ-LXRα-ABCA1 Pathway Foam Cells oxLDL Acidi grassi ossidati ossisteroli CD36 (Meccanismoa feedback) PPARγ Attiva la trascrizione di LXRα RXR α

Efflusso di colesterolo ABCA1 Efflusso di colesterolo (Apo-A1) Sembra,quindi,che il rilascio di colesterolo e lipidi ossidati dalle oxLDL provveda alla clearance dei lipidi attraverso la trascrizione attivata di ABCA1

Induzione di un nuovo profilo trasduttivo (profilo infiammatorio) Uptake delle oxLDL Induzione di un nuovo profilo trasduttivo (profilo infiammatorio) Upregulation di ABCA1 APO-A1 Geni della Flogosi CD36 ABCA1 Regulation of cholesterol efflux in the macrophage A great deal has been learned about the regulation of cholesterol efflux in the macrophage. The cellular transporter ABCA1 is a critical protein that transports excess free cholesterol (FC) out of the cell to an acceptor, lipid-poor apo A-I. ABCA1 gene transcription is regulated by the nuclear receptor heterodimer liver X receptor/retinoid X receptor (LXR/RXR). Cellular oxysterols appear to be one of the endogenous ligands for LXR and promote the transcription of ABCA1. Oxysterols are generated from free cholesterol. Presumably, this represents a homeostatic mechanism by which macrophages rid themselves of excess free cholesterol. LXR gene transcription is also influenced by both peroxisome proliferator-activated receptor  (PPAR-) and PPAR-. HDL oxLDL LXRα PPARγ

anti-inflammatory receptor ABCA1 as an anti-inflammatory receptor

APO-A1 P

ESPERIENZE

Prima Esperienza (FIG.1,A-D) Modello sperimentale: BHK-Cells A n established line of Syrian hamster cells, descended from a clone (Clone 13) isolated by Stoker and McPherson from an unusually rapidly growing primary culture of new born hamster kidney tissue. Usually described as fibroblastic, although smooth muscle like in that they express the muscle intermediate filament protein desmin. Widely used as a viral host, in studies of oncogenic transformation and of cell physiology. TRANSFEZIONE Introduzione di acidi nucleici (DNA,RNA) in cellule eucariotiche. Si avvale dell’uso di genomi virali ingegnerizzati(gene Target,sequenze di integrazione), sfruttando la capacità del virus di trasmettere DNA. (in genere retrotrascrizione tramite Retrovirus)

immunoprecipitazione - + ABCA1 BHK-cells - + - + APO-A1 immunoprecipitazione immunoblotting IP RU-486 IB A JAK2 P-JAK2 JAK2 JAK2 B ABCA1 JAK2 C D ABCA1 P-JAK2

L’incubazione di BHK-cells che esprimono ABCA1 con APO-A1 induce un aumento di Fosfo-JAK2 (N.B. JAK2 si autofosforila,attivandosi, e fosforila un residuo tirosinico su ABCA1)-(Fig.1A) L’aumentata fosforilazione di JAK2 non è direttamente correlata ad un aumento della propria espressione genica: la forma fosforilata,secondo un meccanismo APO-A1/ABCA1-dipendente è relativa ad un pool citoplasmatico preesistente (Fig.1B) L’immunoprecitpitazione di ABCA1 e la rivelazione di JAK2 tramite anticorpi anti-JAK2,(immunoblotting),rivela un’interazione tra ABCA1 e JAK2(non fosforilata) ,non quantitativamente correlabile con il pretrattamento con APO-A1,suggerendo che tale interazione sia costitutiva. (Fig.1C) La forma fosforilata di JAK2,tuttavia,viene rivelata(con anticorpi anti JAK-2-Fosforilato) , solo successivamente a pretrattamento con APO-A1, suggerendo che l’attivazione di JAK2 (P-JAK2) sia da imputarsi all’interazione di APO-A1 con ABCA1. (Fig.1D)

Plasmide vuoto(controllo negativo) Le BHK-Cells che esprimono ABCA1sono state incubate con APO-A1. Il pretrattamento con AG490*(+) è stato operato 30minuti prima. Gli immunoprecipitati(ABCA1) sono stati trattati con anticorpi anti-fosfotirosina. *AG490:potente inibitore della tirosin-chinasi JAK2; permea attraverso la membrana plasmatica.

La tirosin-chinasi JAK2 è responsabile della fosforilazione di ABCA1. Inibitori di JAK2(es.AG490) rivelano,infatti,una minore (ma non nulla)fosforilazione di ABCA1,definibile come “basale”. L’attivazione di JAK2 incrementa di due volte lo stato di fosforilazione di ABCA1

ApoA-I stimulates ABCA1-bound JAK2 autophosphorylation and ABCA1 tyrosine phosphorylation XII JAK2 P -Tyr P P

STAT: Signal Transducers and Activator of Transcription JAK2..e STATs? STAT: Signal Transducers and Activator of Transcription (fattori trascrizionali attivati da Chinasi della famiglia Janus)

2a esperienza (Fig.2) Modello sperimentale -Linea cellulare J774 (macrofagi murini): modello Biologico -BHK-cells Induttori di ABCA1 (N.B.:in assenza dell’induttore,ABCA1 non si rileva!) - TO-901317:agonista non steroideo di LXR,permeante la membrana (in J774,acLDL overnight) -Mifepristone / RU-486 (in BHK-cells)

(/P-STAT5) AG409

L’attivazione di JAK2 lascia prevedere che associato ad ABCA1 sussista un meccanismo di trasduzione tramite il sistema JAK/STAT. L’incubazione con di BHC-cells non transfette non rivela nessun effetto sulla fosforilazione di STAT1,3,5. Tuttavia sia nel modello sperimentale(BHC-Cells transfette cn ABCA1) sia in quello biologico di macrofagi carichi di colesterolo (J774,trattate cn TO-901317 che induce ABCA1),si determina un aumento di P-STAT3 ma solo dopo preincubazione con APO-A1. Tale effetto non si osserva per STAT1,5. L’interazione di APO-A1,induce il reclutamento di STAT3 nonché della tirosin-chinasi-JAK2. STAT3 è fosforilata da JAK2 ApoA1 interactions with ABCA1-expressing cells increases phosporylation of ABCA1- associated STAT3

(prototypic STAT3 docking site) I domini citoplasmatici di legame a STAT3(docking sites) presentano una sequenza aa altamente conservata YXXQ (-Tyr-X-X-Gln-) G aa 19901993 aa 924927 Tyr Y Cys C Tyr Pro P Y Glu Gly Gln Gln Q E G Q gp130 (prototypic STAT3 docking site) ̴ NBD2 ̴ NBD1

3° esperienza ABCA1-WT ABCA1 Y924F ABCA1 Y1990F ABCA1 Y924/1990F Phe Modello sperimentale: transfected BHK-cells (Mifepristone; [ 3H]colesterolo) ABCA1-WT ABCA1 Y924F ABCA1 Y1990F ABCA1 Y924/1990F Phe Tyr 924, 1990 Mutagenesi sito-diretta (QuikChange XL SiteDirected Mutagenesis Kit)

Mutagenesi sito-specifica è una tecnica di biologia molecolare in cui una mutazione è creata in modo selettivo in un particolare sito di una molecola di DNA, solitamente un plasmide. La tecnica differisce quindi dalla normale mutagenesi in cui vengono indotte mutazioni che però si distribuiscono in modo casuale nella sequenze di DNA. In genere la mutagenesi sito specifica richiede la conoscenza della sequenza di tipo selvatico (wild type) del gene da mutagenizzare. La mutazione inserita potrà essere una sostituzione di base o una inserzione o delezione di nucleotidi rispetto alla sequenza originaria.La tecnica è talvolta chiamata anche mutagenesi sito diretta o mutagenesi oligonucleotide diretta. DNAsi di restrizione per DNA metilato

Fig.3

La mutazione sito diretta su ABCA1 dei siti di interazione di STAT3 ha prodotto i risultati attesi:le cellule Y924P,Y1990P e Y924/1990P mostrano una marcata riduzione nella fosforilazione di STAT3 APO-A1-indotta;essa è abolita nelle cellule a doppia mutazione,suggerendo un meccanismo di cooperazione tra i due docking-sites(Fig.3B) La co-immunoprecipitazione di ABCA1 e STAT3 si osserva in cellule WT e non in cellule a doppia mutazione(Y924/1990P),implicando il ruolo determinante di tali siti di legame(aa924,aa1990) nel reclutamento APO-A1 dipendente di STAT3(Fig.3C) Il reclutamento di STAT3,inoltre,sembra essere non richiesto per l’attività di trasporto del colesterolo da parte del trasportatore ABCA1(Fig.3A) Mutating candidate STAT3 docking sites in ABCA1 reduces apoA-I-stimulated STAT3 phosphorylation and ABCA1 association without affecting cholesterol efflux

APO-A1 XII JAK2 P -Tyr (924,1990) P P P-STAT3 P

4° Esperienza IL-6 TNF-α IL-1β Pre-Incubazione con/senza APO-AI (3h) Modello biologico(macrofagi carichi di colesterolo): J774(+colesterolo derivato da acLDL) + TO901317(LXR-agonistABCA1) IL-6 TNF-α IL-1β (RT-PCR) Pre-Incubazione con/senza APO-AI (3h) Incubazione con/senza LPS (3h) [=attivazione cellulare,profilo proinfiammatorio] NF-κB

Fig.4 L’interazione di APO-A1 riduce l’effetto stimolatorio(proinfiammatorio) dell’LPS

RNAi: silenziamento genico a livello post-traduzionale mSTAT3: 5’-AAGGCCGTGGTGGTGCGTGAGAAA-3’ RNAi: silenziamento genico a livello post-traduzionale Scramble siRNA: 5’-GCGTGGAAGCGGAGCATGATA-3’ RNAi is a form of post-transcriptional gene regulation in which double-stranded RNA (dsRNA) molecules called small interfering RNA (siRNA) mediate sequence specific degradation of homologous mRNA.

MP: mouse peritoneal macrophages(+acLDL) STAT3-IB Ctrl STAT3 J774 60% MP 80% 100nM 50nM 100nM siRNA MP: mouse peritoneal macrophages(+acLDL)

SH2-DOMAIN L’interazione di APO-A1 con differenti MP L’interazione di APO-A1 con differenti linee macrofagiche che esprimono ABCA1, deprime la produzione di citochine proinfiammatorie attraverso il sistema JAK2/STAT3 Inbitore solubile di STAT3 SH2-DOMAIN

KnockOut (ricombinasi CRE-Lox) 5° ESPERIENZA Modello in-vivo: Topi C57B/6 che non esprimono STAT3 (˜macrofagi) Cholesterol-loaded macrophages from WT or myloid-specific STAT3 KO mice were pretreated for 3h with apoA-I or 10 ng/ml IL-10 and incubated for 3h with LPS, and cytokine mRNA levels were measured. C57Black/6 KnockOut (ricombinasi CRE-Lox)

Knock-OUT:metodo Cre-Lox LysM STAT-3 Il metodo Knock-out condizionale più usato è il metodo Cre-Lox, che si basa sull’azione della Ricombinasi Cre, che è un enzima che taglia un frammento di Dna inserito tra due siti LoxP: la ricombinasi fa avvenire lo scambio di filamenti (ricombinazione omologa) tra due strutture Lox allineate originando delezione del frammento interposto. Lys-M-Cre/C57BL/6 mouse STAT3 flox/flox/C57BL/6 mouse STAT-3 Macrofagi (STAT3 -/- )

PM= macrofagi peritoneali BMM= macrofagi del midollo osseo WBC= cellule della serie bianca(leucociti) Il K.O. di STAT3 chiaramente deprime l’azione antiinfiammatoria di APO-A1, supportando l’idea di un coinvolgimento centrale di STAT3 (APO-A1 mimics IL-10 in suppressing inflammatory cytokine production) Fig.5

…ABCA1 -/- ? L’abilità di APO-A1 di sopprimere la produzione di citochine pro-infiammatorie (TNF-α ,IL-6) è abolita dal K.O. di ABCA1, Indicando che ABCA1 è primariamente richiesto per l’attività di APO-A1.

APO-A1 JAK2 P-STAT3 P P P Il sistema trasduttivo APO-A1/ABCA1 e IL-10/IL-10R è del tutto analogo! (JAK/STAT3) Dimero P-STAT3 P P

Risoluzione dell’infiammazione STAT3 NETWORK TNF-α IFN-γ IL-1 IL-6 BIRC5 (survivin) HSP-90 MCL1 (BCL2 family) IL-10 family: IL-10 IL-20 IL-22 APO-A1 Risoluzione dell’infiammazione Oncogene

Efflusso del colesterolo Uptake delle oxLDL Induzione di un nuovo profilo trasduttivo (profilo infiammatorio) Upregulation di ABCA1 Efflusso del colesterolo APO-A1 STAT-3 Geni della Flogosi CD36 ABCA1 Regulation of cholesterol efflux in the macrophage A great deal has been learned about the regulation of cholesterol efflux in the macrophage. The cellular transporter ABCA1 is a critical protein that transports excess free cholesterol (FC) out of the cell to an acceptor, lipid-poor apo A-I. ABCA1 gene transcription is regulated by the nuclear receptor heterodimer liver X receptor/retinoid X receptor (LXR/RXR). Cellular oxysterols appear to be one of the endogenous ligands for LXR and promote the transcription of ABCA1. Oxysterols are generated from free cholesterol. Presumably, this represents a homeostatic mechanism by which macrophages rid themselves of excess free cholesterol. LXR gene transcription is also influenced by both peroxisome proliferator-activated receptor  (PPAR-) and PPAR-. HDL oxLDL LXRα PPARγ Attività antiinfiammatoria

Bilancio RESOLUTION Dinamiche di una risposta infiammatoria Centralità nel ruolo dei macrofagi Bilancio Colesterolo PAMP LDL oxLDL RESOLUTION LDL-R Recettori Scavenger Acidi Grassi ossisteroli ABCA1 PPARγ LXR

Segnali proinfiammatori Segnali antiinfiammatori OMEOSTASI Segnali proinfiammatori Segnali antiinfiammatori Livelli plasmatici di HDL (colesterolo HDL > 40 mg/dL ) Funzionalità di ABCA1 Livelli plasmatici di LDL (colesterolo LDL <100mg/dl) Ossidanti/antiossidanti Quota di lipidi ossidati

Pathophysiology

Gene variants ABCA1 GENE Over 70 mutations in ABCA1 have been identified in subjects with low plasma HDL levels ABCA1 GENE 1 3 2

ABCA1 and Cardiovascular disease Numerous population studies have shown an inverse relationship between plasma HDL levels and CVD risk..it‘s clear that the relative activity of ABCA1 plays a role! Subjects with loss-of-function homozygous or heterozygous mutations in ABCA1 have a 4-6 fold higher than normal incidence of CVD,which applies equally to both men and women. Accumulation of sterol-laden “foam cells” in the artery wall and inflammation are early events in formation of atherosclerotic lesions.Thus,ABCA1’s role in cholesterol export and anti-inflammation suggests its impact on ATHEROGENESIS.

ATEROSCLEROSI L’ATEROSCLEROSI è una patologia delle grosse e medie arterie, caratterizzata da lesioni infiltrate di lipidi,definite PLACCHE ATEROMATOSE, che si sviluppano sulla superficie interna dei vasi.

Ateroma (o placca fibrolipidica)

Inflammation & Atherosclerosis Numerose e controverse sono le ipotesi formulate nel tentativo di identificare meccanismi responsabili di comparsa e progressione dell’aterosclerosi. Al momento, la teoria più accreditata è quella infiammatoria di Russel Ross (The response to injury),che ipotizza nell’infiammazione il meccanismo mediante il quale i fattori di rischio cardiovascolare evocano una risposta riparativa da parte della parete vascolare,risposta che inizia con l’attivazione endoteliale (alterazione meramente funzionale), per poi progredire e stabilizzarsi con la formazione della placca aterosclerotica,vera e propria alterazione morfologica. Le basi biologiche dell’infiammazione applicata all’aterosclerosi hanno fornito una nuova chiave di lettura dei meccanismi fisiopatologici,sottolineando il ruolo del RECLUTAMENTO LEUCOCITARIO.

3 4 1 6 2 7 IFN-γ 5 e LDL ox

INFIAMMAZIONE CRONICA Durata relativamente lunga (giorni - anni) Accumulo di linfociti e macrofagi Caratterizzata dalla infiltrazione di linfociti e macrofagi, da proliferazione vascolare e formazione di tessuto fibroso Le cellule predominanti sono, in genere, quelle mononucleate (macrofagi, linfociti) ATEROSCLEROSI=Patologia infiammatoria cronica multifattoriale

Citochine & Aterosclerosi Macrofagi e linfociti secernono una serie di mediatori,tra cui le CITOCHINE, responsabili di amplificare e perpetuare il processo infiammatorio fino alla rottura della placca a livello del cappuccio fibroso,come risultato dello sbilanciamento tra fattori pro- e anti-infiammatori (perdita del BALANCE CITOCHINICO). Non a caso, i pz aterosclerotici presentano elevati livelli sierici di PCR e di citochine pro-infiammatorie (IL-1,IL-6,IFN-γ,etc.)

CITOCHINE Mediatori polipeptidici che fungono da segnali di comunicazione fra le cellule del sistema immunitario, non antigene specifici, e fra queste e diversi organi e tessuti.

La composizione cellulare delle placche vulnerabili è caratterizzata da infiltrati di linfociti Th1 e macrofagi,entrambi attivati dalle LDL ossidate,le quali possono stimolare i monociti a produrre fattori pro-infiammatori e citochine. LDL ox

IFN-γ IFN-γ è la principale citochina per l’ATTIVAZIONE CLASSICA dei macrofagi e svolge importanti funzioni sia nell’immunità innata sia nelle risposte cellulo-mediate specifiche contro i microrganismi intracellulari. IFN-γ signalling pathway

Attività biologiche di IFN-γ

IFN-γ e ABCA1 IFN-γ inibisce l’espressione di LXR,determinando così DOWN REGULATION DI ABCA1 e conseguente diminuzione dell’efflusso di colesterolo dai macrofagi: IFN-γ EFFETTO PRO-ATEROGENICO IFN-γ X

PROLIFERATION

delle metalloproteasi Inibizione produzione L’espressione della citochina anti-infiammatoria IL-10 è stata rilevata negli ateromi umani e suoi alti livelli sono stati associati a significativa riduzione di morte cellulare ed espressione di iNOS. Inibizione di NFkb e delle metalloproteasi IL-10 Linfociti Th1 Linfociti Th2 Inibizione produzione di citochine pro-infiammatorie TNF-α e COX-2 Inibizione apoptosi monociti/macrofagi e soppressione della funzione macrofgica Si può prevedere che la misurazione della concentrazione plasmatica delle citochine pro-infiammatorie nei pz aterosclerotici assumerà nel futuro un’importanza clinica sempre maggiore,che permetterà di individuare terapie mirate per determinati sottogruppi di pazienti.

L’ATEROSCLEROSI si sviluppa anche in soggetti che presentano livelli perfettamente normali di colesterolo e di lipoproteine.Alcuni dei fattori che predispongono all’aterosclerosi sono: (1) inattività fisica e obesità; (2) Diabete mellito; (3) Ipertensione; (4) Iperlipidemia; (5) Fumo. Questi fattori predisponenti interagiscono tra loro in modo sinergico nell’aumentare Il rischio di aterosclerosi.

ABCA1 is highly expressed in islet β-cells, where its selective ablation increases their cholesterol content.These islets have reduced glucose-stimulated insulin secretion,suggesting that the increased cell cholesterol caused by the absence of ABCA1 impairs islet function. rosiglitazone Activation of genes in insulin-responsive cells Rosiglitazone improves glucose tolerance,but these beneficial effects disappear when ABCA1 is ablated in β-cells.These findings suggest that β-cells ABCA1 contributes to The insulin sensitizing effects of thiazolidinediones.

di glucosio e acidi grassi. Difetti di ABCA1 potrebbero essere implicati nelle complicazioni microvascolari del diabete mellito di tipo 2. Due caratteristiche del diabete e della sindrome metabolica sono eccesso di glucosio e acidi grassi. Prolonged hyperglycemia Fosforilazione di ABCA1 AGE Degradazione di ABCA1 Distruzione diretta di ABCA1 nei macrofagi

Previene l’aterosclerosi Conclusioni Livelli plasmatici delle HDL cardioprotettive ABCA1 activity Previene l’aterosclerosi inibendo la formazione di foam cells e sopprimendo l’infiammazione nel fegato nei macrofagi ABCA1 target terapeutico contro aterosclerosi e diabete! nelle β-cellule Stimola la produzione di insulina

Pharmacology Transcription The activity of the ABCA1 pathway can be modulated at multiple levels. Transcription RISCHI: gli agonisti di LXR inducono l’espressione della ACIDO GRASSO SINTASI e di un fattore trascrizionale detto “Sterol Regulatory Binding Protein-1c” (SREBP-1c) che attiva geni di diversi enzimi coinvolti nella biosintesi degli acidi grassi. ipertrigliceridemia Agonisti di LXR inducono la trascrizione di ABCA1 e forniscono un ulteriore vantaggio, inducendo altre proteine coinvolte in alcuni steps del trasporto del colesterolo: ABCG1efflusso di colesterolo alle HDL APO-Eefflusso di colesterolo dai macrofagi in modo sia dipendente che indipendente da ABCA1 ABCG5 e ABCG8escrezione del colesterolo endogeno e di quello esogeno nella bile.

possibile bersaglio di una terapia Agonisti di RXR, il partner eterodimerico di LXR,stimolano anch’essi l’espressione di ABCA1. Rischi: il limite maggiore di questa classe di agonisti è che RXR forma eterodimeri attivi con molti altri recettori nucleari che controllano diversi pathways metabolici.Tuttavia,gli attivatori di RXR inducono ABCA1 senza influenzare i geni target di LXR e ciò rende il “sistema RXR” il possibile bersaglio di una terapia selettiva. Post-transcription Agonisti che stimolano la trascrizione di ABCA1hanno un’efficacia limitata,giacchè i livelli e l’attività di ABCA1 sono regolati soprattutto a livello post-trascrizionale. La ricerca,attualmente,mira allo sviluppo di peptidi e altri piccoli agonisti che interagiscano con ABCA1.Finora,sono stati prodotti alcuni peptidi dotati di α-elica anfipatica di 18- e 37- aa che mimano le interazioni della apolipoproteine con ABCA1. Un potenziale vantaggio di questi peptidi è che si possono somministrare per via orale e hanno una lunga emivita. Uno svantaggio è che essi hanno effetti detergenti non specifici sulle membrane fosfolipidiche e possono accumularsi nei tessuti e danneggiare le cellule. Studi recenti supportano l’ipotesi che peptidi e molecole apolipoproteino-mimetiche potrebbero essere validi agenti terapeutici nel trattamento della CVD e della sindrome metabolica.

…in conclusione…

LDL e oxLDL YIN e YANG Yin e Yang sono opposti Lo Yin e lo Yang sono interdipendenti  Lo Yin e lo Yang si consumano e si sostengono a vicenda  Lo Yin e lo Yang possono trasformarsi l'uno nell'altro  LDL e oxLDL LDL e oxLDL LDL e oxLDL LDL e oxLDL

GRAZIE PER L’ATTENZIONE BUONOMO BARBARA GRAZIE PER L’ATTENZIONE TRAPANI DARIO

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