FERMENTAZIONE Dal punto di vista strettamente chimico, la fermentazione è un processo ossidativo anaerobico svolto da numerosi organismi a carico di carboidrati (o raramente di aminoacidi) per la produzione di energia. Il termine fermentazione andrebbe comunemente riferito alla produzione di alcool e deriva dal latino fervere (ribollire), usato per indicare l'aspetto del mosto durante la preparazione del vino. Nel linguaggio comune, il termine fermentazione è stato ampiamente usato per indicare una qualsiasi trasformazione catalizzata da un microorganismo ed in genere viene usato in relazione a tutti i processi che permettono la moltiplicazione in grande quantità dei microorganismi e l’ottenimento dei loro prodotti metabolici.

Gli elementi necessari per la realizzazione di un processo biotecnologico sono: I ceppi (che devono essere geneticamente stabili per fornire in modo costante ed uniforme il prodotto desiderato). I terreni di coltura (nutriente ottimale). I fermentatori (bioreattori).

Uno schema di processo fermentativo deve prevedere le seguenti fasi: Si parte da un ceppo conservato (liofilizzato o in azoto liquido) e se ne effettua la riattivazione del metabolismo. Fase vegetativa, durante la quale si ha aumento della concentrazione delle cellule e verifica della funzionalità del ceppo. Si prepara quindi l’inoculo, cioè una sospensione densa di cellule. Produzione. Trattamento della massa che esce dal fermentatore per recuperare il prodotto desiderato.

RECUPERO DEI PRODOTTI Un brodo di fermentazione è una miscela acquosa complessa di cellule, prodotti extracellulari solubili, prodotti intracellulari, substrato non metabolizzato, e altri componenti non utilizzabili. La sequenza di operazioni attraverso le quali si arriva dal materiale contenuto nel bioreattore al prodotto finale puro, può essere suddivisa in 4 fasi: Rimozione del particolato (solidi sospesi). Separazione primaria. Purificazione. Isolamento del prodotto finale.

Un’operazione preliminare che può rendersi necessaria per recuperare un prodotto intracellulare è la disintegrazione del materiale cellulare. Ciò può realizzarsi: meccanicamente (taglio, macinazione, ecc.); per lisi della parete e della membrana cellulare sfruttando l’azione di opportuni enzimi.

Esiste una correlazione inversa fra il prezzo di vendita di un prodotto e la sua concentrazione nel brodo di coltura.

1. RIMOZIONE DEL PARTICOLATO I solidi sospesi vengono separati dalla soluzione, usando le tecniche classiche della filtrazione, centrifugazione e sedimentazione, secondo le proprietà iniziali del brodo di fermentazione e della densità finale desiderata del solido recuperato. La miscela che esce dal reattore può avere proprietà che rendono difficile la separazione solido/liquido: spesso è molto viscosa o gelatinosa e il particolato è molto disperso. Quando la miscela ha proprietà che rendono difficile la separazione, si rendono necessari dei pretrattamenti. I più comuni includono una stagionatura, che consente alle cellule di aggregarsi durante l’ultima parte della fase stazionaria, il riscaldamento, la variazione del pH e l’aggiunta di flocculanti (polielettroliti, cloruro di calcio, ecc.)

FILTRAZIONE La miscela solido/liquido viene separata facendo passare il fluido attraverso una barriera porosa (tessuto di cotone o altre fibre, reti metalliche, carta, metalli sinterizzati, prodotti porosi di carbone, ecc.) che trattiene il solido:

vuoto

CENTRIFUGAZIONE La sospensione si muove sotto l’azione della forza centrifuga.

SEDIMENTAZIONE Le particelle sedimentano sotto l’azione della forza gravitazionale.

2. SEPARAZIONE PRIMARIA Durante questa fase viene molto aumentata la concentrazione del prodotto desiderato. Fra le tecniche più usate: estrazione con solventi, adsorbimento, precipitazione ed ultrafiltrazione. Estrazione con solventi: Sfrutta la diversa ripartizione di un soluto fra due fasi liquide immiscibili (acqua/solvente organico): il composto apolare si ripartisce preferenzialmente nel solvente organico (apolare). L’uso di solventi organici non è invece adatto per il recupero di quelle molecole che, come gli enzimi, e altre proteine, non abbiano affinità per i solventi apolari o siano da questi danneggiati.

L’estrazione con solventi organici è largamente impiegata per la separazione di molti antibiotici, in particolare per le penicilline, che hanno struttura: A pH intorno a 7 il gruppo carbossilico è dissociato e la penicillina è solubile in acqua (in forma di sale). Acidificando a pH 2-3, il gruppo COO- viene protonato a COOH e la molecola diventa prevalentemente apolare, e quindi estraibile con un solvente organico apolare (amilacetato o butilacetato). amilacetato Trattando con una soluzione acquosa neutra/alcalina il solvente organico contenente la penicillina, questa viene riportata in fase acquosa.

Attraverso più stadi di estrazione si realizza anche la purificazione del prodotto. L’estrazione viene condotta portando in intimo contatto i due liquidi immiscibili e quindi separando le due fasi. Separatore-estrattore Padbielniak. La rapida rotazione spinge i due fluidi leggero (solvente) e pesante (brodo) a muoversi, a contatto, in controcorrente l’uno all’altro.

Scambio ionico: Le resine a scambio ionico sono polimeri reticolati che portano gruppi ionizzabili acidi (-SO3-H+, -COO-H+) o basici (-NR3+OH-, -NH3+OH-), rispettivamente resine cationiche e anioniche. I controioni H+ o OH- possono essere scambiati con ioni dello stesso segno presenti nella soluzione con cui vengono a contatto:

L’antibiotico streptomicina, nella cui struttura è contenuta un’ammina ciclica (streptamina) ionizzabile, viene recuperata dal brodo di coltura mediante una resina cationica carbossilica: Resinan-(H+)n + strepromicinan+ -> Resinan- strepromicinan+ + nH+ Successivamente, la streptomicina viene recuperata mediante eluizione con acqua acidula, invertendo lo stadio iniziale di adsorbimento e rigenerando la resina.

Il processo viene realizzato in colonne a letto fisso.

Può essere ottenuta in diversi modi: Precipitazione: Può essere ottenuta in diversi modi: Per aggiunta di un precipitante che reagisca col soluto formando un prodotto insolubile, spesso un sale. Per esempio: Solvente organico + streptomicina + H2SO4 streptomicina solfato.2H2O Acido citrico (aq) + Ca(OH)2  citrato di calcio  Glutammato ammonico (aq) + acido  acido glutammico  Per aggiunta alla soluzione acquosa di solventi organici miscibili (metanolo, acetone) si riduce la polarità del mezzo, riducendo anche la solubilità delle sostanze (polari) da recuperare. Il citrato di calcio (o dicitrato di tricalcio tetratridrato) è il sale di calcio dell'acido citrico. C12H10Ca3O14 x 4 H2O

Aggiunta di Sali (salting out) – il meccanismo di azione si basa sulla sottrazione da parte del sale, ad elevata concentrazione, dell’acqua di solvatazione delle biomolecole (polari), che diventano perciò meno solubili. Aggiustamento del pH al punto isoelettrico, al quale la proteina presenta un minimo di solubilità. Addizione di polielettroliti che agiscono come flocculanti (promuovono l’aggregazione e la sedimentazione di particelle colloidali che altrimenti rimarrebbero stabilmente in sospensione per molto tempo). Riscaldamento (caso tipico delle proteine): in questo modo la proteina globulare si denatura, srotolandosi e presentando verso l’esterno un maggior numero di residui idrofobi, diminuendo così la sua solubilità.

ultrafiltrazione: Passaggio del fluido sotto l’azione di pressioni piuttosto elevate, attraverso una membrana, in genere finemente porosa, che ferma le grosse molecole. Applicata per la separazione di proteine (enzimi) e altre macromolecole.

3. PURIFICAZIONE In questa fase si cerca di concentrare ulteriormente il prodotto oltre che rimuovere la maggior parte delle impurezze residue. Le tecniche più usate a questo scopo sono soprattutto l’adsorbimento e vari tipi di cromatografia. Precipitazione frazionata Proteine con diversi punti isoelettrici possono essere separate variando il pH.

Cromatografia a setacci molecolari Permette di separare molecole di diverse dimensioni. La colonna è riempita con particelle di gel con pori di una dimensione caratteristica. Le molecole di dimensioni maggiori non possono diffondere nel gel e passano rapidamente attraverso la colonna, mentre le specie più piccole penetrano nel gel e si muovono più lentamente.

Cromatografia di affinità Nella cromatografia di affinità (peculiare delle biotecnologie) si sfrutta la specificità naturale che molte macromolecole biologiche presentano per certe sostanze che, fissate su un supporto, legano molto rapidamente e molto selettivamente la propria “controparte”.

ISOLAMENTO DEL PRODOTTO FINALE Gli ultimi trattamenti servono ad ottenere il prodotto desiderato nella forma più adatta alla sua commercializzazione. Il prodotto, se commercializzato sotto forma di solido, può essere cristallizzato da una soluzione, centrifugato per ridurne l’umidità ed infine essiccato. Cristallizzazione – si raggiunge la sovrasaturazione del soluto, con conseguente sua precipitazione, raffreddando la soluzione (nel caso che la solubilità diminuisca al diminuire della temperatura) o evaporando il solvente, eventualmente operando sotto vuoto per abbassare la temperatura di ebollizione dello stesso.

Cristallizzazione evaporativa a circolazione forzata

Essiccamento Generalmente viene realizzato facendo passare aria calda attraverso il prodotto umido. Liofilizzazione – è un metodo di essiccamento in cui il campione viene prima congelato e poi sottoposto ad una forte depressione che, per successivo blando riscaldamento, provoca la sublimazione dell’acqua. La liofilizzazione è molto utile per essiccare tutte quelle sostanze che non sono danneggiate dal congelamento, come per molti microorganismi, vaccini, proteine, ecc. inoltre la struttura porosa lasciata dalla sublimazione facilita la reidratazione.