Risposta Adattativa Indotta da Esposizioni a Radiofrequenza in Linfociti Umani Coltivati in vitro Anna Sannino1, Olga Zeni1, Stefania Romeo1, Rita Massa1,2, Vijayalaxmi3, Maria Rosaria Scarfì1 scarfi.mr@irea.cnr.it 1ICEmB c/o CNR, IREA - Via Diocleziano, 328 – 80124 Napoli; 2ICEmB c/o Università Federico II, Dipartimento di Scienze Fisiche, CMSA, Via Cintia, 80126 Napoli; 3University of Texas, Department of Pathology, Health Science Centre, San Antonio, TX 78229, USA Pisa, 30-31 maggio 2012

Ben documentata in radiobiologia in vitro & in vivo RISPOSTA ADATTATIVA Capacità di una dose estremamente bassa di un agente mutageno fisico o chimico (dose adattante) di ridurre l’effetto di un successivo trattamento a dosi maggiori dello stesso agente o di un agente diverso (dose challenge) Ben documentata in radiobiologia in vitro & in vivo E. Coli, cellule di mammifero e vegetali, roditori, lavoratori Agenti induttori – radiazioni ionizzanti & mutageni chimici Endpoints Pisa, 30-31 maggio 2012

FATTORI CHE INFLUENZANO LA AR RISPOSTA ADATTATIVA Fenomeno eterogeneo – il 75% della popolazione esibisce RA, (tratti costituzionali e non fenomeni fisiologici transitori) FATTORI CHE INFLUENZANO LA AR MECCANISMI SUGGERITI Dose usata per l’adattamento (AD) Dose rate (RI) Intervallo di tempo tra la AD e la CD Fase del ciclo cellulare in cui viene data la AD Efficiente riparo del DNA Regolazione del ciclo cellulare Induzione di apoptosi Efficiente detossificazione dei radicali liberi NON c’è un meccanismo di azione universalmente riconosciuto Pisa, 30-31 maggio 2012 3

Radiofrequenze e danno al DNA La possibilità che esposizioni a RF inducano danno al DNA è stata ampiamente valutata a causa della correlazione diretta tra effetti genotossici e cancerogenesi La maggior parte della letteratura indica che Esposizioni a RF non sono in grado di indurre danno diretto al DNA in vitro Meltz ML, Bioelectromagnetics Suppl. 6: S196 - S213 (2003) Vijayalaxmi and Obe, Radiat Res 162: 481 – 496 (2004) Verschaeve L. Toxicol. Appl.Pharmacol. 207: S336 – S341 (2005) Moulder et al., Int J Radiat Biol. 81: 189 - 203 (2005) Vijayalaxmi and Prihoda, Radiat Res, 169: 561 – 574 (2008) Juutilainen et al., ICNIRP 16/2009: 103 – 118 (2009) Pisa, 30-31 maggio 2012

IARC Classification of Radiofrequency Electromagnetic Fields (IARC Monographs Series, Vol. 102) Group 1: "Carcinogenic to humans" There is enough evidence to conclude that it can cause cancer in humans. Group 2A: "Probably carcinogenic to humans" There is strong evidence that it can cause cancer in humans, but at present it is not conclusive. Group 2B: "Possibly carcinogenic to humans" There is some evidence that it can cause cancer in humans but at present it is far from conclusive. Group 3: "Unclassifiable as to carcinogenicity in humans" There is no evidence at present that it causes cancer in humans. Group 4: "Probably not carcinogenic to humans" There is strong evidence that it does not cause cancer in humans. Definizione IARC : Categoria di agenti per i quali c’è una limitata evidenza di cancerogenesi nell’uomo e una insufficiente evidenza di cancerogenesi negli animali da esperimento Associazione positiva per gliomi in utilizzatori di telefoni cellulari da più di 7 anni. Risultati simili per il neurinoma acustico ma su un numero minore di casi Pisa, 30-31 maggio 2012 5 5

nel nostro laboratorio La maggior parte degli studi in letteratura è stata eseguita impiegando radiazioni ionizzanti come AD e/o CD per indurre RA nel nostro laboratorio Campi a RF per determinare se radiazioni non ionizzanti sono in grado di indurre risposta adattativa in linfociti umani da sangue periferico Induzione di AR valutata come danno al DNA applicando il test del micronucleo (MN) col blocco della citodieresi Pisa, 30-31 maggio 2012

MICRONUCLEUS ASSAY S phase anaphase Cyt-B Pisa, 30-31 maggio 2012

Protocollo Sperimentale Colture da 3 ml (sangue periferico da donatori sani) Esposizioni a RF (20 h) come dose adattante (AD) MMC (100 ng/ml) come dose challenge (CD) Controlli positivi: colture trattate con MMC sia come AD (1 ng/ml) sia come CD (100 ng/ml) Controllo 1 ng/ml MMC a 24h (AD) 100 ng/ml MMC a 48h (CD) 1+100 ng/ml MMC (AD+CD) Sham RF (AD) Sham + MMC (100 ng/ml) (CD) RF + MMC (100 ng/ml) (AD+CD) t=0 t=24h t=48h t=72h PHA Cyt-B CD-MMC Cell harvest t=44h S phase RF 20h in fase S Frequenza di MN su 2000 cellule/trattamento Pisa, 30-31 maggio 2012

% Decremento del danno al DNA Analisi dei risultati % Decremento del danno al DNA [(danno atteso* – danno osservato)/atteso] x 100 *danno atteso (MN) nei trattamenti combinati (AD + CD) calcolato come la somma di MN nei due trattamenti individuali meno il numero di MN nelle colture non trattate (controllo) Analisi Statistica La significatività statistica della riduzione del danno osservato rispetto a quello atteso è stata calcolata per ogni soggetto esaminato col test z a coppie; nell’insieme i trattamenti sono stati analizzati col t di Student per dati appaiati Pisa, 30-31 maggio 2012

Attività sperimentale I° studio – valutazione dell’induzione di RA in seguito a esposizioni a 900 MHz, GSM, SAR 1.25 W/kg in fase S del ciclo cellulare II° studio – ruolo della dalla fase del ciclo cellulare dell’induzione di Risposta Adattativa da RF III° studio – valutazione della dipendenza dai parametri elettromagnetici nell’induzione di RA da RF IV° studio – valutazione della dipendenza dal meccanismo di azione dell’agente challenge nell’induzione di RA da RF In corso di svolgimento – valutazione della dipendenza dal tipo cellulare e meccanismo di azione coinvolto nella RA da RF Pisa, 30-31 maggio 2012

Applicatore: Wire Patch Cells 900 MHz (GSM), SAR medio 1.25 W/kg Due piastre parallele, cortocircuitate agli angoli da quattro cilindri Piccole dimensioni (15x15x3cm) Alloggiamento in incubatori standard per colture cellulari (controllo delle condizioni ambientali) I° studio Per evitare interferenze radiative con il sistema di controllo elettronico dell’incubatore, le WPC sono ospitate in gabbie schermanti rivestite da pannelli assorbenti Esposizioni simultanee di 4 Petri ( 3.5 cm) nelle stesse condizioni di esposizione Pisa, 30-31 maggio 2012

Sistema di esposizione I° studio Sistema a due canali, controllato da remoto per il monitoraggio delle potenze nelle WPCs per garantire la procedura in cieco INCUBATOR VSWR METER 1 SIGNAL GENERATOR 1 SIGNAL GENERATOR 2 AMPLIFIER 1 AMPLIFIER 2 VSWR METER 2 Feedback Net power (?) ? FIBER OPTIC THERMOMETER Due spiraline sulle facce esterne delle WPC con acqua circolante a 36.8 °C per garantire nelle Petri esposte 36.8-37.1°C T° misurata in colture dummy durante le 20 h di esposizione Pisa, 30-31 maggio 2012

Efficienza media della WPC: 0.35 W/kg/W ± 28% tra le misure Dosimetria I° studio Dosimetria numerica – Computer Simulation Technology (CST) (tecnica dell’integrazione finita) per determinare i valori di SAR e la distribuzione nel campione 4 Petri ( 3.5 cm) Caratteristiche dei materiali: sangue ’= 61; =1.54 S/m; terreno: ’= 61; =1.54 S/m Altezza della miscela 3 mm Risoluzione del modello: 1 mm size cells Set up del sistema di esposizione e dosimetria approvati dalla FDA (progetto CRADA, in collaborazione con l’ENEA – Casaccia) Scarfì et al., Rad. Res. 165, 655-663 (2006) Dosimetria sperimentale- 4 Petri con 3 ml di terreno posizionate come per la simulazione. Misure di temperatura in cinque punti per ogni Petri. SAR medio valutato per ogni Petri Efficienza media della WPC: 0.35 W/kg/W ± 28% tra le misure Pisa, 30-31 maggio 2012

RISULTATI I° studio 20 h di esposizione a RF nella fase S/G2 del ciclo cellulare inducono un significativo decremento del danno al DNA indotto da MMC (AR) *P<0.01 L’entità della RA variava tra i donatori (decremento di danno al DNA compreso tra 35-56%) Pisa, 30-31 maggio 2012

L’esposizione a RF non induce effetti genotossici RISULTATI I° studio L’esposizione a RF non induce effetti genotossici I linfociti di tutti i donatori esaminati hanno una frequenza di MN simile nelle colture esposte e sham-esposte (p=0.453) Pisa, 30-31 maggio 2012

20h di esposizione (900 MHz, GSM, SAR 1.25 W/kg) I° studio 20h di esposizione (900 MHz, GSM, SAR 1.25 W/kg) assenza di effetti genotossici e citotossici in linfociti umani Produzione di un “trigger” in grado di indurre RA: protezione da un successivo trattamento con una dose challenge di un agente genotossico (MMC) Pisa, 30-31 maggio 2012

verificare l’induzione di RA in differenti fasi del ciclo cellulare Scopo II° studio Confermare le osservazioni precedenti su un maggior numero di individui verificare l’induzione di RA in differenti fasi del ciclo cellulare 6-8 h 24-30 h dopo 45 h mitogeno Ciclo cellulare in linfociti umani Preston et al., Mut Res 189: 175-183 (1987) Bender et al., Mut Res 196: 103–159 (1988) Pisa, 30-31 maggio 2012

20 h di esposizione in G0: prima della stimolazione con mitogeno II° studio (900 MHz, GSM, average SAR 1.25 W/kg) in G0: prima della stimolazione con mitogeno in G1: da 4 a 24 h dopo la stimolazione in fase S: da 24 a 44 h dopo la stimolazione (= studio I) t=0 t=4h t=24h t=48h t=72h PHA Cyt-B CD-MMC Cell harvest G1 phase t=44h S phase RF G0 phase Pisa, 30-31 maggio 2012

Validazione dei risultati precedenti su un maggior numero di individui II° studio Esposizioni a RF in fase S inducono un significativo decremento del danno al DNA indotto da MMC (AR) Validazione dei risultati precedenti su un maggior numero di individui Pisa, 30-31 maggio 2012

RISULTATI II° studio Esposizioni a RF in fase G0 o G1 non proteggono da un successivo trattamento genotossico Pisa, 30-31 maggio 2012 20

II° studio Significativo decremento del danno indotto da MMC (adattamento) in cellule esposte a RF in fase S (24-44h) Nessun effetto della RF in fase G0 (prima della stimolazione) o G1 (da 4 a 24 h dalla stimolazione) Nessun effetto della sola esposizione a RF Conferma delle osservazioni precedenti su un maggior numero di individui Relazione tra la fase del ciclo cellulare in cui avviene l’esposizione e l’induzione di RA Pisa, 30-31 maggio 2012 21

Scopo III° studio Estendere la caratterizzazione della RA indotta da RF in linfociti umani valutando l’induzione dell’adattamento in differenti condizioni di esposizione (frequenza, modulazione, SAR) AD: 20 h RF in fase S; CD: 100 ng/ml MMC a 48 h f = 1950 MHz; UMTS; SAR: 1.25, 0.6, 0.3, 0.15 W/kg Pisa, 30-31 maggio 2012

Sistema di esposizione e dosimetria III° studio Inserendo 4 Petri (colture da 3ml), si ottiene un SAR più elevato nelle posizioni centrali rispetto alle posizioni esterne e, fissando opportunamente la distanza il centro dei campioni si ottiene un rapporto di 1:4 tra i valori di SAR interno ed esterno 1.25 W/kg 0.3 W/kg 0.6 W/kg 0.15 W/kg Modulazione WCDMA, in accordo con le specifiche 3GPP 3.5 2001-03 (cinque canali di dati + un canale di controllo) Guida d’onda cortocircuitata alloggiata in un incubatore a CO2 per colture cellulari In condizioni di campo elettrico parallelo, elevata efficienza (fino a 80 %) e limitata disuniformità di SAR (meno del 30 %) Pisa, 30-31 maggio 2012

Controllo della Temperatura III° studio Esperimenti preliminari per monitorare l’andamento della T° durante le 20 h di esposizione al SAR maggiore (1.25 W/kg) mediante un termometro a fibra ottica inserito in orizzontale nella coltura Misure a intervalli di 5 sec La variazione di T° non ha mai superato l’accuratezza dello strumento (± 0.3 °C). Cinque misure indipendenti Ulteriori misure di T° a intervalli regolari durante la fase sperimentale Sham esposizioni in un applicatore identico, alloggiato nello stesso incubatore, ma senza segnale Pisa, 30-31 maggio 2012 24

RISULTATI Nessun effetto della sola RF III° studio Nessun effetto della sola RF RF data come AD induce un significativo decremento del danno indotto da MMC (AR) solo con 0,3 W/kg *P<0.01 -44% -52% L’entità dell’adattamento variava al variare degli otto donatori esaminati Pisa, 30-31 maggio 2012 25

20h di esposizione a RF (1950 MHz, modulazione UMTS) III° studio 20h di esposizione a RF (1950 MHz, modulazione UMTS) nessun effetto della sola RF; induzione di AR – protezione da un successivo trattamento con MMC; effetto dipendente dal SAR; effetto simile a quello osservato in linfociti esposti a 900 MHz (GSM) Pisa, 30-31 maggio 2012

AD: 20 h RF in fase S; CD: 1 o 1.5 Gy RX a 48 h Scopo IV° studio Verificare se la RA indotta da esposizioni a RF è dipendente dal meccanismo di azione con cui l’agente utilizzato come challenge induce danno al DNA MMC - induttore di crosslinks (legami crociati tra le eliche del DNA) Raggi X - induttori di rotture dirette al DNA AD: 20 h RF in fase S; CD: 1 o 1.5 Gy RX a 48 h f = 1950 MHz; UMTS; SAR: 0.3 W/kg Pisa, 30-31 maggio 2012

RISULTATI Nessun effetto della sola RF IV° studio Nessun effetto della sola RF L’esposizione a RF induce un significativo decremento del danno indotto da 1.5 Gy di RX Nessun effetto sul danno indotto da dosi minori (1 Gy) Risultati ottenuti da colture di linfociti da quattro donatori Progetto INFN – ARCAICA (2010 -2011) CNR – IREA & Dipartimento di Scienze Fisiche, Università Federico II (G Gialanella, GF Grossi, L Manti, P Scampoli) Manoscritto in corso di stesura Pisa, 30-31 maggio 2012

attività in corso impiego di tipi cellulari differenti per valutare la RA da RF in dipendenza dal tipo cellulare (fibroblasti di roditore) b. valutazione dei meccanismi alla base della RA da RF (apoptosi, ciclo cellulare, enzimi di riparo del DNA) c. Valutazione di altre condizioni sperimentali in grado di indurre RA (durate dell’esposizione, campi statici, campi ELF, ….) Pisa, 30-31 maggio 2012

PLoS ONE 7(2): e32040. doi:10.1371/journal.pone.0032040 Recentemente, due gruppi di ricerca indipendenti hanno riportato che pre-esposizioni a RF inducono AR in roditori esposti ad alte dosi di radiazioni ionizzanti Pre-esposizioni di topi a 900 MHz (GSM), 120 µW/cm2 1 h/g per 14 gg e poi a una dose letale di raggi gamma (8 Gy) inducevano un significativo incremento di sopravvivenza rispetto ad animali esposti solo ai raggi gamma. (Cao et al., 2011). Pre-esposizioni di topi a 900 MHz at 120 µW/cm2 per 4 h/g per 1, 3, 5, 7 e 14 gg e poi esposti a una dose acuta di raggi gamma (3 Gy) inducevano un significativo decremento del danno al DNA (comet) rispetto ad animali esposti solo ai raggi gamma. (Cao et al., 2012). Jiang B, Nie J, Zhou Z, Zhang J, Tong J, et al. (2012) Adaptive Response in Mice Exposed to 900 MHz Radiofrequency Fields: Primary DNA Damage. PLoS ONE 7(2): e32040. doi:10.1371/journal.pone.0032040 Pisa, 30-31 maggio 2012

Recentemente, due gruppi di ricerca indipendenti hanno riportato che pre-esposizioni a RF inducono AR in roditori esposti ad alte dosi di radiazioni ionizzanti Pre-esposizioni di topi (6 h/g per 5 gg) a 900 MHz (GSM, SAR 1.2 W/kg) e ratti per 6 gg e poi esposti a una dose letale di raggi gamma (8.8 Gy) inducono aumento di sopravvivenza rispetto alle esposizioni con soli raggi gamma (Mortazavi et al., 2011) Pisa, 30-31 maggio 2012

CONCLUSIONI La caratterizzazione di RA da RF potrebbe aprire nuove prospettive verso l’uso delle radiazioni non ionizzanti per la protezione dell’uomo dall’azione genotossica di trattamenti per scopi diagnostici (rischio di trasformazione cellulare dovuto alle conseguenze di esposizioni protratte a basse dosi di RI) La resistenza indotta da pre-esposizioni a RF da comuni sorgenti quali i telefoni cellulari potrebbe interferire con la risposta a successivi trattamenti terapeutici Pisa, 30-31 maggio 2012