STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI GLICOGENOSI TIPO 2: STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI Giancarlo Parenti

Glicogenosi 2 (Malattia di Pompe) Frequenza: 1: 40.000 Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA)

Endoplasmic reticulum Autophagy Golgi apparatus Autophagosome Phagocytosis Primary lysosomes exocytosis Secondary lysosomes Exocytosis Late endosome Residual bodies endocytosis Early endosome

Endoplasmic reticulum Autophagy Golgi apparatus Autophagosome Phagocytosis Primary lysosomes exocytosis Secondary lysosomes Exocytosis Late endosome Residual bodies endocytosis Early endosome

Endoplasmic reticulum Autophagy Golgi apparatus Autophagosome Phagocytosis Primary lysosomes exocytosis Secondary lysosomes Exocytosis Late endosome Residual bodies endocytosis Early endosome

Glicogenosi 2 (Malattia di Pompe) Frequenza: 1: 40.000 Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Eterogeneità genetica: 272 mutazioni del gene GAA finora descritte (http://www.pompecenter.nl) mutazione

Glicogenosi 2 (Malattia di Pompe) Frequenza: 1: 40.000 Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in: cuore muscolo scheletrico fegato

Malattia di Pompe Frequenza: 1: 40.000 Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in: cuore muscolo scheletrico fegato

Malattia di Pompe Frequenza: 1: 40.000 Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in: cuore muscolo scheletrico fegato

Malattia di Pompe Variabilità clinica: Esordio precoce: classica infantile, non classica Esordio tardivo: seconda infanzia, giovanile, adulta Primi segni exitus 1 Età, mesi 12 Deficit motori, Sedia a rotelle Supporto ventilatorio Primi segni 10 Età, anni 20 30

Malattia di Pompe Terapia enzimatica sostitutiva Recombinant human a-glucosidase from rabbit milk in Pompe patients Hannerieke Van den Hout, Arnold JJ Reuser, Arnold G Vulto, M Christa Loonen, Adri Cromme-Dijkhuis, Ans T Van der Ploeg THE LANCET . Vol 356 . July 29, 2000 therapy (weeks) 200 400 600 800 LVMI (g/m2) 6 12 18 24 36 32

Terapia enzimatica sostitutiva nella malattia di Pompe problemi Effetto variabile nelle forme tardive Scarsa efficacia sulle fibre muscolari tipo II In modelli animali sono richieste dosi molto alte (100 mg/kg/infusione) negli stati avanzati di malattia

Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Per funzionare un enzima deve avere una struttura (“folding”) corretta

Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Un enzima deve maturare correttamente

Endoplasmic reticulum Autophagy Phagocytosis Exocytosis Autophagosome exocytosis endocytosis Primary lysosomes Secondary Residual bodies Early endosome Late Endoplasmic reticulum Golgi apparatus Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Un enzima deve funzionare nel posto giusto

Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Gli chaperones migliorano il “folding” di un enzima mutato Gli chaperones migliorano la maturazione dell’enzima Gli chaperones migliorano il traffico dell’enzima verso la sede corretta

Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Il miglioramento del “folding”, della maturazione e del “trafficking” si traducono in un aumento dell’attività residua

Deoxynojirimycin (DNJ) Both compounds are inhibitors of glycosidases and glycosyltransferases NB-DNJ is used as substrate reducing agent in Gaucher disease IC50 for a-glucosidase 0.38 mM (DNJ) and 1.9 mM (NB-DNJ) (Andersson et al, 2004) OH CH2OH NH Deoxynojirimycin (DNJ) CH3 OH CH2OH N N-butyl deoxynojirimycin (NB-DNJ)

Pazienti studiati Pt fenotipo mutazione mutazione proteina DNA 1 Infantile non-classico (INC) 1655 C>T L552P 2 c.-35C>A Splicing anomalo 3 Giovanile (J) 1333G>C A445P 4 Giovanile(J) 1645G>C c.692+1G>C G549R 5 1064T>C L355P 6 c.-45T>G unknown sconosciuta 7 Infantile classico (IC) 1124G>T R375L 8 n.a. n.a

Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Attività

GAA activity in fibroblasts from Pompe patients GAA activity untreated Control values 58.5 + 28.1 4 3 (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity 2 1 Patient Phenotype Genotype 1 INC L552P 2 INC L552P abn splic 3 J L552P A445P 4 J G549R abn splic 5 J L355P 6 J abn splic unknown 7 IC R375L 8 IC n.a.

GAA activity in fibroblasts from Pompe patients GAA activity + NB-DNJ + DNJ untreated Control values 58.5 + 28.1 4 3 (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity 2 1 Patient Phenotype Genotype 1 INC L552P 2 INC L552P abn splic 3 J L552P A445P 4 J G549R abn splic 5 J L355P 6 J abn splic unknown 7 IC R375L 8 IC n.a.

GAA activity in fibroblasts from Pompe patients GAA activity + NB-DNJ + DNJ untreated Control values 58.5 + 28.1 4 p<0.001 3 p<0.004 (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity p<0.019 p<0.002 p<0.001 2 p<0.002 p<0.008 1 p<0.010 Patient Phenotype Genotype 1 INC L552P 2 INC L552P abn splic 3 J L552P A445P 4 J G549R abn splic 5 J L355P 6 J abn splic unknown 7 IC R375L 8 IC n.a.

Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Maturazione

Western blot analysis - + - + fibroblasts Patient 1 4 7 contr Phenotype NCI J CI Genotype L552P/L552P G549R/ abn splicing R375L/R375L NB-DNJ - + 110 kDa 70-76 kDa -actin 110 kDa 70-76 kDa -actin 95 kDa HEK293T 293 w.t. L552P G549R A445P R375L NB-DNJ - +

Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici “Trafficking”

GAA a m. di Pompe b m. di Pompe + chaperone c normale

GAA LAMP2 a d m. di Pompe b e m. di Pompe + chaperone c f normale

a d g b e h c f i GAA LAMP2 Merge m. di Pompe m. di Pompe + chaperone normale

Stimolazione enzimatica della GAA con chaperones Sommario Mutazione Fenotipo Aumento attivita’ Effetto sulla maturazione L552P intermedio + G549R lieve A445P severo - L355P R375L S529V lieve + E521K severo - M519T Y455F lieve + P545L intermedio

Stimolazione enzimatica della GAA con chaperones Sommario Pazienti studiati 21

Stimolazione enzimatica della GAA con chaperones Sommario Pazienti studiati Aumento attivita’ % Nessun aumento 21 5 23.8 16 76.2

Conclusioni Due farmaci (DNJ e NB-DNJ) migliorano l’attività enzimatica della GAA Per il momento sono disponibili solo dati in vitro, cioè in cellule di laboratorio L’effetto positivo dei farmaci si osserva solo in cellule di pazienti con specifiche mutazioni del gene GAA Questi risultati potrebbero indicare un possibile trattamento alternativo alla terapia enzimatica sostitutiva almeno in alcuni pazienti

Programma di ricerca futuro Identificazione di mutazioni responsive al trattamento con chaperones Uso combinato di terapia enzimatica sostitutiva e chaperones Valutazione in vivo

Francesca Donaudy Barbara Rossi Monica Cardone Ida Annunziata Germana Meroni Andrea Ballabio Giancarlo Parenti Alfredo Zuppaldi Rosaria Tuzzi Katia Porto Generoso Andria Giancarlo Parenti

Mutations expressed at the Dept of Pediatrics - Tigem 100 untreated + DNJ 75 (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity 50 25 e.v. w.t. Am 03 Am 04 Am 05 Am 06 Am 07 Am 08 Am 09 Am 10 552 549 529 445 375 521 519

aa position at exon boundaries Pharmacological enhancement of mutated a-Glucosidase in fibroblasts from Patients with Pompe Disease Expression of single mutations in HEK293T 182 231 286 318 359 399 442 480 517 546 585 680 730 778 827 882 933 952 630 140 233 398 470 652 925 110 kDa intracellular membrane bound 110 kDa secreted 95-76 kDa 70 kDa active site Glycosylation sites aa position at exon boundaries 76 kDa

Imino sugar treatment in Pompe disease aa position at exon boundaries Summary Y455F S529V G549R P549L L552P Glycosylation sites 140 233 398 470 652 882 925 182 286 359 442 517 585 680 778 882 952 aa position at exon boundaries 231 318 399 480 546 630 730 827 933

Catalytic site GAA model structure red non-responsive mutations green responsive mutations Catalytic site FUGUE Sequence-structure homology recognition / SWISS MODEL

Lysosomal storage diseases in which pharmacological chaperone effects have been demonstrated Enzyme deficiency Reference Fabry disease a-galactosidase A Fan et al, 1999 Asano et al, 2000 Frustaci et al, 2001 GM1 gangliosidosis b-galactosidase Matsuda et al, 2003 GM2 gangliosidosis b-hexosaminidase Tropak et al, 2004 Gaucher disease b-glucosidase Sawkar et al, 2005

ERT (20 mg/kg/week) in a Pompe KO mouse Raben et al, 2003 GAA activity (nmol/mg/hr) % normal Glycogen clearance % Muscle 0.7 +/- 0.1 9.7 38 Heart 3.8 +/- 0.3 32.5 95 Liver 493.0 +/- 27.1 2464.0 75

ERT (100 mg/kg/week) in a Pompe KO mouse Raben et al, 2003 GAA activity (nmol/mg/hr) % normal Glycogen clearance % Muscle 2.5 +/- 0.3 32.6 74 Heart 9.4 +/- 1.4 99.0 98 Liver 559.0 +/- 13.7 2798.0

Enzyme enhancement by pharmacological chaperones Messenger RNA 3’ 5’ ribosome Endoplasmic reticulum membrane lumen Molecular chaperones protein Correct folding and assembly Misfolding Wild type protein mutant protein Golgi apparatus Degradation lysosome

Enzyme enhancement by pharmacological chaperones Messenger RNA 3’ 5’ ribosome Endoplasmic reticulum membrane Pharmacological chaperone lumen Molecular chaperones protein Correct folding and assembly Misfolding Wild type protein mutant protein Golgi apparatus Golgi apparatus Degradation lysosome lysosome

Effects of NB-DNJ concentrations and time course of GAA enhancement Range of plasma concentrations in Gaucher patients treated with NB-DNJ (Cox et al, 2000) 5 4 (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity 3 2 1 10 20 30 50 80 3 6 9 13 15 NB-DNJ concentration (mM) Time (days)

Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Gli chaperones migliorano il “folding” delle proteine