I risultati delle analisi dipendono dal metodo analitico utilizzato; pertanto occorre associare ad ogni criterio microbiologico un metodo di riferimento specifico. Tuttavia, gli operatori del settore alimentare devono avere la possibilità di usare metodi d’analisi diversi dai metodi di riferimento, in particolare quelli più rapidi, a condizione che tramite tali metodi alternativi si ottengano risultati equivalenti. Reg. (CE) 2073, punto 24 delle considerazioni preliminari

TECNICHE COLTURALI ALTERNATIVE MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA TECNICHE COLTURALI ALTERNATIVE Substrati cromogeni per attività enzimatiche - genere-specifiche[C 4 esterasi per Salmonella sp] - specie-specifiche [ glucuronidasi per E. coli, fosfolipasi C per L. monocyto- genes] Terreni colturali disidratati, selettivi e non Vantaggi Limitazioni  Economia e praticità  Comparabilità con i metodi colturali di riferimento (validazione secondo ISO 16140:2003)  Elevata specificità per i cromogeni  Interferenza del substrato alimentare

COLONIE VERDE -BLU CON ALONE OPACO ALOA Agar Listeria acc. to Ottaviani & Agosti Selettivo e differenziale per L. monocytogenes AGENTI SELETTIVI AGENTI DIFFERENZIALI LITIO CLORURO ACIDO NALIDIXICO CEFTAZIDIME CICLOEXIMIDE POLIMIXINA B X-GLUCOPIRANOSIDE ß-glucosidasi COLONIE VERDE-BLU SUBSTRATO PER FOSFOLIPASI (fosfatidilinositolo) fosfolipasi COLONIE VERDE -BLU CON ALONE OPACO 3 4

I principi del terreno ALOA (Agar Listeria di Ottaviani ed Agosti) Colonia blu verde: attività beta glucosidasica Listeria sp. Alone opaco: attività fosfolipasica L. monocytogenes

Listeria monocytogenes: colonie verdi-blu con alone opaco AGAR LISTERIA acc. to OTTAVIANI & AGOSTI ALOA - COLONIE CARATTERISTICHE Listeria monocytogenes: colonie verdi-blu con alone opaco L. monocytogenes L. innocua Listeria non monocytogenes: colonie verdi-blu senza alone 7

Coltura mista di L. monocytogenes (minoritaria) ed L Coltura mista di L. monocytogenes (minoritaria) ed L. innocua (maggioritaria) su OXFORD (dx), PALCAM (sx) ed ALOA (centro)

TECNICHE IMMUNOLOGICHE MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA TECNICHE IMMUNOLOGICHE Per la ricerca di microrganismi (precedentemente coltivati) tramite anticorpi specifici marcati con enzimi attivi su substrati cromogenici (ELISA) o fluorogenici (ELFA) oppure coniugati con particelle di lattice in sistemi analitici che sfruttano la migrazione per capillarità su supporti permeabili (immunocromatografia, lateral flow). Vantaggi Limitazioni  Velocità di risposta  Variabile densità cellulare per la rilevazione del segnale enzimatico  Possibile automazione  Possibile interferenza del substrato alimentare Per la ricerca e quantificazione, con i medesimi principi (ELISA, ELFA, LA Latex Agglutination nella versione Reverse Passive, ovvero RPLA), di metabolici batterici e fungini.

MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA TECNICHE IMMUNOLOGICHE Vantaggi Limitazioni  Economia e praticità  Sensibilità variabile secondo la fonte commerciale ed il substrato alimentare Rapid Test Performance  Possibili interferenze del Evaluation Program (GIPSA) substrato alimentare Possibile uso delle colonne di immunoaffinità e della tecnica immunomagnetica (IMS o ICS) per la “pulizia” del campione e per la concentrazione dell’analita cercato

MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA TECNICHE STRUMENTALI Dirette, con misurazione della biomassa in mezzi colturali liquidi, selettivi e non: biofotometria, optofluorimetria Dirette, con misurazione di un costituente cellulare: bioluminometria (ATP) Indirette, con misurazione degli effetti del metabolismo microbico sullo stato fisico del mezzo di prova: impedometria (modificazione della conducibilità elettrica) Vantaggi Limitazioni  Velocità di risposta  Correlazione con i metodi colturali di riferimento  Possibile automazione  Interferenza del substrato alimentare

Correlation Coef. (R): -0,97 Log(CFU/MI) = 9,240 – 0,388*DT Correlation Coef. (R): -0,97 CBT MACINATI 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Log CFU 0 6 12 18 24 Detection Time (Hours)

MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA TECNICHE GENETICHE Biologia molecolare per ridurre i tempi di rilevazione ed aumentare il grado di affidabilità tassonomica: - ibridazione degli acidi nucleici (riconoscimento di una sequenza bersaglio del microrganismo ricercato tramite l’aggiunta di una sonda nucleica che ha una sequenza complementare) - amplificazione del DNA (RNA) bersaglio tramite l’enzima polimerasi (PCR) e misura dinamica della reazione di ibridazione (RT PCR: Real Time PCR). Vantaggi Limitazioni  Velocità di risposta  Contaminazioni incrociate (ambienti, operatori, manualità)  Sensibilità  Inibitori dell’enzima polimerasi  Specificità  Sequenza bersaglio specie- specifica

MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA TECNICHE GENETICHE Biologia molecolare per i bersagli non coltivabili o difficilmente coltivabili con mezzi convenzionali: - RT-PCR per virus ( es. nei molluschi). Biologia molecolare per la tipizzazione molecolare (impronta genetica) degli stipiti isolati in luoghi, momenti e processi diversi di una filiera produttiva: - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) su operons di r RNA (ribotipizzazione) - RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)