SILSIS-MI VIII ciclo – secondo anno / GEOGRAFIA FISICA GIANMARIO GERARDI – Y04585 Classe scolastica: II liceo Classico (equivalente IV superiore) - Corso di Biologia Tempi: 2 ore Le biotecnologie - Mezzo secolo di biologia I fondamenti Gli strumenti attuali più importanti Gli ambiti applicativi Le prospettive e gli interrogativi

Mezzo secolo di biologia 1944 Hershey e Martha Chase studiando virus batterici, e Avery occupandosi di batteri patogeni, dimostrano che il DNA è materiale genetico in grado di trasferire caratteristiche metaboliche da un organismo all’altro. 1953 Watson e Creek determinano la struttura del DNA 1961 Niremberg decifra il codice genetico 1973 Boyer e Cohen fondano la tecnologia del DNA ricombinante 1976 Maxam e Gilbert e in un altro laboratorio Sanger mettono a punto 2 diversi metodi per sequenziare il DNA. Il metodo di Sanger, automatizzato, è tuttora utilizzato 1978 Genentech produce insulina umana ricombinante in E.coli 1982 Primo vaccino animale prodotto con tecnologie ricombinanti introdotto in UE 1983 Impiego di un vettore per il trasferimento di geni esogeni nelle piante 1988 Reazione a catena della polimerasi (PCR) 1990 Inizio del Progetto Genoma Umano 1996 Sequenziamento completo del genoma di S. cerevisiae 1997 Clonazione di un mammifero (Dolly) 2000 Annuncio della conclusione Sequenziamento Genoma Umano

SILSIS-MI VIII ciclo – secondo anno / GEOGRAFIA FISICA GIANMARIO GERARDI – Y04585 Le biotecnologie Mezzo secolo di biologia Conoscenze e proprietà fondanti Gli strumenti attuali più importanti Gli ambiti applicativi Le prospettive e gli interrogativi

1953 il DNA: la Doppia Elica di Watson e Creek Grazie agli studi di diffrazione ai raggi X, che molto probabilmente segnarono il destino di Rosalind Franklin, Watson e Creek risolvono l’enigma di una molecola sorprendentemente ordinata e geometrica.

Il concetto di Complementarietà… La denaturazione di una molecola di DNA rompe i ponti H tra le basi azotate: Si liberano due eliche COMPLEMENTARI.

…e il concetto di Ibridazione Tratti anche piuttosto lunghi (diverse decine di pb) di DNA a singola elica di qualunque provenienza, anche artificiale, si IBRIDANO facilmente ad un’elica di DNA costituita dalla sequenza complementare. Si forma una doppia elica corretta.

La genetica di Escherichia coli Colonia di Escherichia coli Il DNA di un batterio è raccolto in un unico cromosoma circolare. In alcune situazioni specifiche, un tratto di DNA può essere scambiato e trasferito come caratteristica fenotipica da un organismo ad un altro uguale, ricordando il concetto Mendelliano di trasmissione di un GENE.

Una parte del DNA in E. coli talvolta si trova su brevi sequenze circolari: i Plasmidi Cromosoma (4.5 Mb) Trasformazione Plasmide (~2-100 kb) plasmide Molti batteri, come E. coli, possono essere dotati anche di un DNA circolare a doppia elica, molto più piccolo del cromosoma (~1:1000): il plasmide. Può essere presente anche in numerose copie. In condizioni favorevoli opportune, un plasmide libero entra con facilità in un batterio e può anche successivamente uscirvi.

Le funzioni del DNA Plasmidico Esistono moltissimi tipi di plasmidi, con proprietà diverse. In generale le loro attività naturali possibili sono le seguenti: si replicano e segregano alla divisione (anche se non sempre) spesso portano 1 o più geni per resistenze ad antibiotici possono portare anche geni metabolici ed esprimerli possono ricombinare con il cromosoma batterico e scambiare tratti di DNA possono trasferirsi in atri batteri per “coniugazione batterica” attraverso i pili possono comportarsi da vettori di DNA cromosomico trasferendone dei brevi tratti in un altro batterio. Proteina

Gli enzimi di Restrizione I batteri possiedono enzimi deputati alla digestione di DNA estraneo, ad esempio virale, i quali non tagliano a caso, ma riconoscono sequenze specifiche di basi azotate. Oggi se ne conoscono più di cento. Filamenti diversi di DNA, tagliati da un enzima di restrizione che genera estremità di taglio sfalsate (“coesive”), possono ibridare e legarsi. Le potenzialità di questo “taglia e cuci” sono enormi. Regione del taglio sfalsato Regione di riconoscimento EcoRI riconosce la sequenza GAATTC e taglia DNA in quel punto, generando 2 frammenti di DNA. 5’ 3’

La Ricombinazione omologa Il DNA possiede la capacità di ibridarsi a regioni di DNA omologo per semplice affiancamento. Il termine RICOMBINAZIONE è ripreso dal concetto classico Mendelliano. La prima evidenza al microscopio fu quella dei chiasmi del crossing-over della meiosi, ma il fenomeno si era già reso noto in termini teorici studiando il comportamento dei plasmidi batterici.

La Ricombinazione omologa DNA esogeno DNA genomico Tratti di DNA omologo possono ricombinare fra loro e consentire lo scambio di sequenze d’interesse

L’Analisi dei frammenti di DNA - Il DNA è carico negativamente Corso su un gel di agarosio in un campo elettrico si separa in base alla lunghezza del frammento o al suo grado di avvolgimento Le basi vengono regolarmente intercalate da EtBr che è visibile in luce UV

La PCR: la Reazione di polimerizzazione a catena: Animazione Vengono sfruttate le seguenti proprietà: Condizioni di lavoro semplici dell’enzima DNApolimerasi Notevole velocità di reazione (anche centinaia bp/sec) Innesco di lavoro dell’enzima basato su brevi sequenze “primer” Separazione delle doppie eliche per denaturazione

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Il DNA Ricombinante A: plasmide tagliato Taglio dell’enzima di restrizione A: plasmide tagliato B: gene esogeno tagliato con lo stesso enzima C: inserzione del gene

Gli Inserti e il Clonaggio genico Il termine di DNA ricombinante ha origine sempre dal concetto di ricombinazione genica. Qui si tratta di una ricombinazione per inserzione. All’interno dei plasmidi, un gene esogeno di qualunque provenienza, può essere clonato e replicato in colture batteriche. Il gene può essere inserito a valle di sequenze batteriche promotore, anche inducibili, e portare all’espressione di proteine di qualunque altro organismo all’interno del batterio.

Le Banche geniche

Le Banche di Plasmidi e di Fagi I singoli cloni di DNA genomico vengono riconosciuti da piccole sonde nucleotidiche di sequenza nota, marcate e rintracciabili

DNA complementare (cDNA) Le banche di cDNA da estratti cellulari di mRNA AAAAA-3’ mRNA 7-mG Oligo (dT) TTTTT AAAAA-3’ 7-mG TTTT-5’ OH Trascrittasi inversa dATP, dCTP, dTTP, dGTP AAAAA-3’ 7-mG TTTT-5’ OH-3’ La Trascrittasi inversa è un enzima scoperto nei retrovirus. Questo enzima consente di ottenere DNA complementare al mRNA. Vantaggi del cDNA: - è un gene funzionante sotto qualunque promotore è composto solo da esoni Frammento di Klenow dATP, dCTP, dTTP, dGTP AAAAA-3’ 7-mG TTTT-5’ Rnasi H Nucleasi S1 TTTT-5’ DNA complementare (cDNA)

I nuovi Micro Array: un’evoluzione Si tratta di prodotti soprattutto “commerciali”: Banche di cDNA, relative a organismi o a tessuti, predisposte su microchips di pochi cm Vengono fatte ibridare a cDNA provenienti da mRNA estratti da cellule o altro Indicano in tempi brevissimi l’induzione di determinati geni in condizioni specifiche Sono supportati da una rapidissima analisi informatica

Le proteine Ricombinanti (OGM a tutti gli effetti!)

L’Espressione di proteine ricombinanti

La Trasfezione cellulare Proteina cell Trasfezione del costrutto mRNA

L’Inibizione dell’espressione genica (il silenziamento) cell Trasfezione del costrutto antisenso (la trascrizione di questo gene produce un mRNA as) RNA-antisenso mRNA DEGRADAZIONE mRNA prodotto dal nucleo di una cellula eucariote

Gli Small Interfering RNA (siRNA) È un altro tipo di Silenziamento Basato su un meccanismo fisiologico recentemente scoperto, in cui gli siRNA dirigono il riconoscimento e la degradazione di mRNA da parte di un enzima specifico effettuando una regolazione negativa.

Il Sequenziamento del DNA

Il Sequenziamento di un genoma Sequenziare un genoma non significa conoscere il funzionamento di ogni gene Offre l’opportunità di rintracciare quelli di cui possediamo qualche evidenza

La Ricostruzione della sequenza La ricostruzione della sequenza viene effettuata grazie all’uso di enzimi di restrizione diversi

I Marcatori molecolari Vi sono approcci di analisi del DNA in grado di mettere in evidenza caratteristiche degli individui altrimenti invisibili: Mutazioni Associazioni a caratteristiche fenotipiche specifiche Attribuzione di paternità o parentela Un’ “impronta digitale” inconfondibile Sono basati sugli effetti in larga scala di tagli enzimatici di restrizione o di amplificazioni di sequenza Un punto del genoma in grado di rendersi evidente solo in casi specifici È un marcatore molecolare Se fossimo ciechi e sordi e dovessimo trovare un asino in mezzo a dei cavalli, avremmo a disposizione almeno 3 “marcatori”: la lunghezza del pelo, l’altezza al garrese e la lunghezza delle orecchie!

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La Cura e la Prevenzione di Malattie Le proteine ricombinanti possono essere usate come farmaci (insulina) e consentono la produzione in larga scala di anticorpi sempre ad impiego farmacologico: Contro tumori Contro malattie degenerative La diagnosi genetica molecolare consente di individuare precocemente molte malattie, compreso i tumori L’impiego di marcatori molecolari consente di eliminare i dubbi sulla presenza di certe alterazioni genetiche

La codifica del nostro Genoma 1999 (Dicembre) Pubblicata su Nature la sequenza completa del cromosoma 22. 2000 (Maggio) pubblicata su Nature la sequenza completa del cromosoma 21. 2000 (Giugno) Francis Collins e Craig Venter annunciano congiuntamente di aver completato la "bozza" del genoma Umano. 2001 La bozza completa del genoma umano (che gli inglesi chiamano working draft) è pubblicata su Nature (quella del consorzio pubblico) e su Science (quella della Celera).

Il Miglioramento genetico di piante (e animali) Stato Milioni di ha Coltivati con OGM % di ogm prodotti USA 49,8 55,3 Soia,mais,cotone,zucca,colza Argentina 17,1 19 Soia, mais, cotone Brasile 9,4 10 Soia Canada 5,8 6,4 Colza, mais, soia Cina 3,3 3,6 Cotone Paraguay 1,8 2 India 1,3 1,4 Sud Africa 0,5 Mais, soia, cotone Uruguay 0,3 Soia, mais Australia Romania 0,1 Messico Soia, cotone Spagna Mais Filippine TOTALE 90 milioni di ha 100 % Fino ad oggi, nell’impiego di OGM vegetali (VGM), non si sono ancora verificati danni, né alla salute, né di tipo ambientale. Le paure riguardo al futuro per ora sono solo ascrivibili ad oggettive speculazioni.

Gli animali Transgenici Gli organismi animali transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti Esempio: generazione di topi transgenici mediante microiniezione di DNA nei pronuclei maschili

La Clonazione degli animali

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Contro malattie degenerative Le Terapie geniche Il silenziamento o la supplementazione dei geni in tessuti malati offre possibilità di applicazione davvero enormi Contro tumori Contro malattie degenerative Cellule malate potrebbero essere prelevate da tessuti malati, modificate geneticamente e reimpiantate Anche cellule embrionali potrebbero essere curate per modificazione genetica e reimpiantate

L’uso delle cellule Staminali a fini terapeutici Riparazione di un tessuto Eliminazione problemi di rigetto

La creazione di Nuovi Organismi Le caratteristiche genetiche di organismi utili all’uomo potrebbero essere amplificate anche notevolmente Recentemente è stato creato un riso ricco di vit. A e si sta cercando di creare piante e microorganismi mangiatori di sostanze di rifiuto o inquinanti La manipolazione protratta e approfondita potrebbe consentire di creare veri e propri nuovi organismi

L’uomo si Interroga Il primo OGM moderno fu ottenuto nel 1973 da Stanley Cohen (Stanford University School of Medicine) e Herbert Boyer (University of California, San Francisco) che, grazie all'uso delle nuove tecniche di biologia molecolare riuscirono per primi a clonare un gene in E. coli dimostrando che era possibile trasferire materiale genetico da un organismo ad un altro tramite l'utilizzo di vettori plasmidici in grado di autoreplicarsi, abbattendo di fatto le barriere specie-specifiche. Alla luce della portata di tali risultati, nel 1974, la comunità scientifica si autoimpose una moratoria internazionale sull'uso della tecnica del DNA ricombinante per valutare la nuova tecnologia ed i suoi possibili rischi. Fino a che punto è lecita la manipolazione genetica dell’uomo? Quali scenari mostra la possibilità di clonare una persona?

Abbiamo realmente in mano il Segreto della Vita?