CENTRIFUGAZIONE Una centrifuga è uno strumento progettato per produrre una forza centrifuga superiore alla forza di gravità terrestre. Le particelle in soluzione se lasciate in condizioni di quiete tenderanno a sedimentare per effetto della gravità. Per ogni particella la velocità alla quale essa sedimenta è proporzionale alla forza applicata, conseguentemente macromolecole in soluzione sedimentano più velocemente quando la forza applicata è maggiore di quella di gravità esercitata dalla terra. Scopo delle tecniche di separazione per centrifugazione Esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale terrestre aumentando la velocità di sedimentazione delle macromolecole, col fine di separare macromolecole che differiscono per densità, forma e dimensioni e quindi sedimentano con velocità diversa sotto l’influenza di un campo centrifugo applicato.

TIPI DI CENTRIFUGHE (refrigerate e non refrigerate) Centrifughe a bassa velocià (max3.000-6.000 g) si usano per raccogliere organelli di grandi dimensioni e precipitati grossolani. Microcentrifughe (10.000 g) sono capaci di accelerazioni rapide. Centrifughe a flusso continuo utili per raccogliere grandi volumi di cellule. Durante la centrifugazione le particelle sedimetano mentre il liquido scorre attraverso il rotore. Centrifughe ad alta velocità (max 60.000g) utili per frazionamento cellulare. Ultracentrifughe (MAX 600.000 g) possiedono sistemi di vuoto e refrigerazione sofisticati e vengono usate per isolare piccoli organelli come i ribosomi e le vescicole di membrana.

Tecniche centrifugative Le tecniche di separazione per centrifugazione si basano sul comportamento delle particelle quando esse vengono sottoposte ad un campo centrifugo. Tecniche di centrifugazione preparativa: permettono di separare, isolare e purificare cellule intere, organuli subcellulari, membrane plasmatiche, polisomi, ribosomi, cromatina, acidi nucleici, complessi proteici e virus. Tecniche di centrifugazione analitica: servono a studiare macromolecole già pure o praticamente pure.

Tipi di rotore Rotore ad angolo fisso

Rotore basculante

Principi base della sedimentazione La velocità di sedimentazione dipende dal campo centrifugo G, diretto radicalmente verso l’esterno. Il campo è funzione del quadrato della velocità angolare del rotore (w espressa in rad s-1) e della distanza radiale (r ) espressa in centimetri della particella dall’asse di rotazione. Campo centrifugo G= w2 r La velocità del rotore può essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto (rev min –1). Il campo centrifugo G espresso in termini di rivoluzioni al minuto è espresso come multiplo della forza gravitazionale terrestre (g= 980 cm/s), cioè come rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo e il peso della stessa sottoposta alla sola forza di gravità. Esso viene quindi riportato come campo centrifugo relativo o più semplicemente come “numero di g”.

Quando si riportano le condizioni di separazione di particelle è necessario specificare la velocità del rotore, le dimensioni del raggio e il tempo di centrifugazione. La velocità di sedimentazione dipende comunque anche dalla massa della particella; 2) dalla densità del mezzo; 3) dalla forma della particella. Questi parametri pratici ovviamente modificano l’equazione teorica. Coefficiente di sedimentazione La velocità di sedimentazione (v) di una particella può essere anche espressa in termini di velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato, più comunemente chiamato coefficiente di sedimentazione, s. Il valore sperimentale per il coefficiente di sedimentazione è una funzione della temperatura, viscosità e densità della soluzione.

Per convenzione il coefficiente di sedimentazione determinato viene corretto in quel valore che si otterrebbe in acqua a 20°C e viene riportato come coefficiente di sedimentazione standard, s20,w. Il coefficiente di sedimentazione di molte macromolecole, inclusi acidi nucleici e proteine, di norma diminuisce all’aumentare della concentrazione del soluto. Per questo motivo si misura il coefficiente a diverse concentrazioni di soluto e si estrapola il valore a concentrazione nulla. Per la maggior parte delle particelle biologiche i coefficienti di sedimentazione sono valori molto piccoli e, per convenzione, il loro valore unitario di base è: 10-13 s , detta unità Svedberg (S) Ad esempio, una molecola di RNA ribosomale che ha un coefficiente di sedimentazione pari a 5x10-13 s ha un valore di 5 S In genere, più grande è la molecola o la particella e maggiore è la sua unità Svedberg. Pertanto maggiore la sua velocità di sedimentazione. Esempi: enzimi, ormoni tra 2 a 25 S Acidi nucleici tra 3 a 100 S Ribosomi e polisomi tra 20 a 200 S Virus tra 40 a 1000 S

Centrifughe e loro utilizzo Piccole centrifughe da banco. Generalmente la loro velocità massima è tra 4.000 e 6.000 rev min –1 , per un campo centrifugo relativo variabile tra i 3.000 e i 7.000 g. Microcentrifughe. 8.000-13.000 rev min –1 pari a 10.000g Centrifughe refrigerate a grande capacità 6.000 rev min –1 Centrifughe refrigerate ad alta velocità 25.000 rev min –1

Ultracentrifughe preparative Possiedono rotori in grado di raggiungere 80.000 rev min –1 e di generare un campo centrifugo relativo di 600.000 g. La camera del rotore è refrigerata, sigillata e viene mantenuto il vuoto all’interno onde minimizzare gli attriti che si possono generare tra il rotore in movimento e l’aria e che causerebbero un aumento di temperatura. Il sistema di controllo della temperatura utilizza un sensore a infrarossi che registra di continuo la temperatura. Ultracentrifughe analitiche La velocità raggiunge i 70.000 rev min –1 (500.000 g). Sono costituite da un rotore alloggiato in una camera in cui sia stato fatto il vuoto e di un sistema ottico di rivelazione del materiale che va sedimentandosi durante la centrifugazione. Importante! Sempre equilibrare le provette!!!

Frazionamento cellulare Le cellule possono essere rotte in vario modo: shock osmotico, ultrasuoni, frantumandole per omogeneizzazione. Questi procedimenti rompono molte membrane ma lasciano intatti gli organuli che possono essere separati sulla base delle loro dimensioni e densità.

Metodi di separazione Sedimentazione differenziale: la centrifugazione di una sospensione di particelle per un tempo determinato provoca la formazione di un sedimento e di un sovranatante

Centrifugazione in gradiente di densità Si utilizza una soluzione la cui densità aumenta in gradiente Continuo(a) Gradienti Discontinuo (b) Una barriera di densità a gradino singolo per sedimentare selettivamente una particella (c)

Centrifugazione Zonale Si crea un gradiente poco ripido e le macromolecole si separeranno in funzione della massa ( quelle più grandi si muoveranno più velocemente)

Centrifugazione Isopicnica Si basa sulla formazione di un gradiente ripido (molte sostanze come il saccarosio o il ficoll creano dei gradienti durante la centrifugazione). Si mescola il campione da separare con la sostanza appropriata e si centrifuga per il tempo necessario per la formazione dei gradienti. Le particelle sedimentano in funzione della loro densità (si posizionano dove la loro densità è uguale a quella del mezzo)

Classificazione CENTRIFUGHE per velocità VELOCITA' BASSA MEDIA ALTA ULTRA Velocità (rpm) 7.000 14.000 26.000 100/150.000* Gravità (xg) 7.200 18.000  75.000 800/901.000* Capacità 9 litri 1 litro 3 litri 1.500/40 ml Raffreddamento no alcune tutte Vuoto Equipaggiamento angolo fisso  oscillante  micropiastre  cyto angolo fisso  oscillante  micropiastre  tamburo angolo fisso  oscillante  verticale  zonale  flusso continuo  tamburo angolo fisso  oscillante  verticale  neo-verticale  zonale  flusso continuo Materiale (equipaggiamento) mat. plastico  alluminio alluminio  composito alluminio  composito  titanio Posizionamento banco/pavimento pavimento/banco

Tipo di separazione tipo equipagg. Pelleting Isopicnica Rate-zonal angolo fisso eccellente variabile* no oscillante inefficiente buono verticale zonale *  buono:  macromolecole  inefficiente:  cellule,  nuclei,  mitocondri

Selezione delle bottiglie e/o provette La scelta del tipo di provetta o bottiglia più adatta alla centrifugazione dovrà tener conto dei seguenti fattori: adattabilità agli alloggiamenti dell'equipaggiamento rotante resistenza meccanica (rottura delle provette) resistenza chimica resistenza alla temperatura trasparenza autoclavabilità facilità di pulizia sterilizzazione economicità La resistenza meccanica delle provette in plastica è influenzata da diversi fattori: limiti fisici dei materiali costruttivi, interazione di tali limiti con agenti chimici, presenza o meno di tappi di chiusura, lavaggi, processi di sterilizzazione, tempo e durata della centrifugazione. I prodotti chimici influenzano le caratteristiche meccaniche, la flessibilità e le proprietà fisiche delle provette.

I materiali per provette più utilizzati sono: Polipropilene copolimero (PA) Copolimero lineare con aggiunta di etilene e propilene; disponibile con parete sottile e spessa, normalmente elencato come PA (Poliallomero). Ha buone proprietà chimiche e di media trasparenza; adatto per pelletting e separazione in gradiente di densità. Eccellente per essere tagliato (sliceable) o perforato (pierceable) e ideale per centrifugazioni a bassa temperatura. Sia a temperatura ambiente che a bassa temperatura di centrifugazione, ha buona resistenza meccanica a basse e medie velocità.   Policarbonato (PC) Trasparente e rigido, buona resistenza agli acidi con ottima compatibilità verso le soluzioni di acido diluito. Disponibile con parete spessa e sottile, in tubi o bottiglie. Autoclavabile e riutilizzabile. Sia a temperatura ambiente che a basse temperature di centrifugazione, mantiene la propria rigidità e resistenza meccanica anche ad alte velocità. Polipropilene (PP) Traslucido. Buone proprietà chimiche. Richiesto quando è necessario ottenere una netta interfaccia tra separazioni di particelle con diverso coefficiente di densità (layer). A temperatura ambiente mantiene la propria forma originale e la propria resistenza meccanica anche ad alte velocità.  A basse temperature di centrifugazione non è consigliabile, dato che aumenta la propria fragilità.

Polietilene (CPE) Polimero opaco, ideale per acido acetico o idrofluorico. Adatto per taglio e foratura, nelle centrifugazioni in gradiente. Utilizzato quando necessitano basse temperature di centrifugazione. Polistirene (PS) Rigido e non tossico; trasparente e compatibile con la maggior parte delle soluzioni acquose. Normalmente utilizzato per pelletting. Polisulfone (Phenylene-Isopropylidene) (PSF) Di colore giallo trasparente. Resistente agli acidi, basi, alcool e idrocarburi. Ottima resistenza alla temperatura. Teflon  (FEP) Traslucido, flessibile e ad alta densità. Resiste a temperature di esercizio molto basse. Eccellente con Acetone  e altri solventi. Autoclavabile e sterilizzabile. Riduce le proprie qualità quando utilizzato ad alta forza di gravità con temperature  >20 °C. Vetro (VJ) Duran 50 Vetro (VS) Vetro soffiato Corex (C) Per centrifugazioni a basse e medie velocità. Cinque volte più resistente del vetro convenzionale. Buono per alte temperature. La vita media delle provette in vetro è in funzione della frequenza d'uso, della accelerazione centrifuga relativa, dei lavaggi, abrasioni, cura del trattamento. Gli sforzi sviluppati in questi processi si accumulano nei vetri VJ e VS, i quali peraltro hanno un'eccellente resistenza chimica e possono sopportare velocità moderate se usati con gli opportuni riduttori/adattatori. Con gli appositi riduttori/adattatori le provette in Corex possono essere usate a velocità medio-alte.