Il progetto GENOMA Marta Franceschetti

Classe: Va Liceo Psicopedagogico Momento del percorso formativo Mod.1 – Mendel e la Genetica Classica Mod.2 – Acidi nucleici e Sintesi delle Proteine Mod.3 – Genetica Molecolare Regolazione dell’espressione genica Tecnologie del DNA ricombinante Il progetto Genoma Umano

Prerequisiti: Struttura di DNA e RNA Meccanismi di Duplicazione, Trascrizione e Traduzione Mappatura Genetica Plasmidi e Virus come vettori genetici Obiettivi Didattici Definizione, Scopi e prospettive di un Progetto Genoma Fasi necessarie al sequenziamento Tappe storiche del Progetto Genoma Umano Era post genomica Implicazioni Etiche e Politiche Obiettivi Formativi Importanza della collaborazione e condivisione dei risultati scientifici Ogni nuova conoscenza scientifica ha implicazioni etiche e sociali

GENOMA:. Insieme delle informazioni genetiche GENOMA: Insieme delle informazioni genetiche depositate nella sequenza del DNA delle cellule. Progetto Genoma Umano: si propone di descrivere completamente il genoma umano mediante il sequenziamento del DNA Determinazione della sequenza lineare delle basi che lo compongono (3.12 x109 bp)

Obiettivi del Progetto Genoma Umano: Creazione di accurate mappe fisiche dei cromosomi umani Sviluppo di tecnlogie di supporto e di attrezzature per la ricerca Espansione delle reti di comunicazione e della capacità di archiviazione ed elaborazione dei dati. Identificazione di alterazioni nella sequenza di DNA determinanti lo sviluppo di patologie umane – geni malattia. Comprendere le basi genetiche dell’evoluzione e del funzionamento dell’organismo umano.

Per ottenere la Sequenza del DNA: Suddividere il DNA in frammenti più piccoli Amplificazione dei segmenti di DNA Sequenziamento vero e proprio Analisi dei dati (Bioinformatica)

Amplificazione dei plasmidi e del segmento esogeno Scoperti nel 1978 nei batteri come meccanismo di difesa dall’infezione di patogeni Suddividere il DNA in frammenti più piccoli: Meccanicamente Utilizzando Enzimi di Restrizione

Costruzione di una Genoteca – Banca Genomica

Amplificazione mediante PCR (K. Mullis 1985)

Sequenziamento Metodo di Sanger (1977) Didesossinucleoside

Sequenziamento Automatico: marcatori fluorescenti rilevati da laser Ogni nucleotide si associa ad una colorazione diversa: ddATP ddTTP ddGTP ddCTP Consente di avere un’unica reazione ed un’unica corsia

Ordinamento dei segmenti per sovrapposizione di sequenza - Bioinformatica

Diverso modo di procedere tra: Consorzio Pubblico Approccio Top Down Celera Genomics Approccio Whole Genome Shotgun Diverso modo di procedere tra: DNA Genomico Clonaggio in vettori per grossi inserti di DNA (YAC, BAC, PAC) e assemblaggio per zone di sovrapposizione Subclonaggio in vettori da sequenziamento Sequenziamento Frammenti casuali derivanti da rottura meccanica del DNA clonati in vettori da sequenziamento Sequenziamento automatico Ricostruzione computerizzata della sequenza genomica

LE TAPPE DEL PROGETTO GENOMA 1985 K. Mullis inventa la PCR per amplificare frammenti di DNA. 1986 R.Dulbecco e L.Hood lanciano l'idea di sequenziare l'intero genoma Umano. 1990 Negli Stati Uniti nasce ufficialmente lo Human Genome Project (HGP), sotto la guida di James Watson. Negli anni successivi Regno Unito, Giappone, Francia, Germania, Cina si uniscono al progetto formando un consorzio pubblico internazionale. In Italia il progetto genoma nasce nel 1987 ma si interrompe nel 1995. 1992 Craig Venter lascia l'NIH. Fonda la compagnia privata Celera Genomics, portando avanti un progetto genoma parallelo. 1993 F. Collins e J. Sulston diventano direttori rispettivamente del National Human Genome Research Center negli USA e del Sanger Center in Inghilterra, i 2 principali centri coinvolti nel HGP. 2000 (Giugno) Francis Collins e Craig Venter annunciano congiuntamente di aver completato la "bozza" del genoma Umano. 2001 La bozza completa del genoma umano (che gli inglesi chiamano working draft) è pubblicata su Nature (quella del consorzio pubblico) e su Science (quella della Celera).

Febbraio 2001: Pubblicazione del Genoma Umano Alla fine, tutti e 2 gli approcci sono stati utili: quello di Venter per la sua efficienza, automazione e rapidita’, quello del consorzio pubblico per ordinare esattamente le sequenze ripetute

Il numero di geni stimato scende da 50.000-100.000 a circa 30.000 Dopo il sequenziamento… Il numero di geni stimato scende da 50.000-100.000 a circa 30.000 Il gene umano medio Lunghezza 17.000 coppie di basi (17 kb) Numero di esoni 7 Lunghezza dell’esone 100-200 nucleotidi Lunghezza dell’introne 200-2.000 nucleotidi

Progetti Ancillari – Sequenziamento del Genoma di altri organismi

Organismo Stima dimensioni Genoma Stima n°di geni H. Sapiens 3000 million bases 30,000 M. Musculus (mouse) 3000 million bases 30,000 Drosophila (fruit fly) 180 million bases 13,061 Arabidopsis (plant) 100 million bases 25,000 C. elegans (roundworm) 97 million bases 19,099 S. cerevisiae (yeast) 12.1 million bases 6,034 E. coli (bacteria) 4.67 million bases 3,237 Che cosa ci rende umani? Inoltre il 60% delle proteine umane previste mostra similarità di sequenza con proteine presenti in altre specie (drosofila, lievito) IPOTESI  regolazione genica efficienza di splicing interazioni proteina-proteina

Utilità della Genomica Comparativa Le sequenze altamente conservate è più probabile codifichino per proteine funzionalmente importanti. Informazioni sull’evoluzione. Determinazione delle peculiarità umane rispetto ad altre specie. Studio della funzione genica in condizioni normali o patologiche indotte in modelli sperimentali.

Progetti Ancillari – Human Genome Diversity Project La variabilità genetica è determinata dalle mutazioni che rendono due individui diversi. Il Genoma Umano nucleare di due individui è conservato per il 99,9%, il rimanente 0,1% racchiude quelle differenze che rendono i due individui diversi. Ricaduta immediata: poiché le sequenze finali sono state ottenute sovrapponendo la sequenza di individui diversi, è stato possibile indivisuare un numero molto alto di polimorfismi di singoli nucleotidi (SNPs)

Che cosa è cambiato? Problema: Identificazione della corrispondenza Gene Fenotipo Che cosa è cambiato? Problema: Identificazione della corrispondenza Era Pre-Genomica Analisi genetica classica Carattere Identificazione prodotto genico implicato Sequenza genica putativa Ricerca in banca dati Isolamento del gene e sua caratterizzazione Era Post-Genomica Analisi genetica inversa Sequenza di DNA Analisi bioinformatica Funzione putativa Analisi Funzionale

Ma ancora… La sequenza del DNA non è sufficiente 1) Identificazione di tutti i geni (???) 2) Studio della loro espressione e funzione, in condizioni sia fisiologiche che patologiche 3) Comprensione del ruolo biologico delle sequenze intergeniche Con la Genomica… Trascrittomica  • Proteomica  • Genomica Strutturale • Knockout studies Terapia Genica Test diagnostici

E’ possibile brevettare le sequenze nucleotidiche che compongono i vari geni? La ricerca sul genoma umano ha un valore universale e quindi dovrebbe essere patrimonio di tutti. Ma l’elevato costo, sia umano sia tecnologico, può essere sostenuto solo con la vendita delle conoscenze acquisite. Brevettabilità dei geni implicati in gravi malattie ereditarie di cui si potrebbe avere un test diagnostico. Determinismo genetico – Influenza ambientale … Nel 1999 Venter avanzò la richiesta di brevettare tutte le sequenze geniche di cui era in possesso fino a quel momento. Il governo americano decise che non si può brevettare una sequenza, ma solo la conoscenza che si ha su di essa. Quindi per brevettare un gene è importante conoscerne la funzione o almeno la potenziale rilevanza.

Fine