Università degli Studi di Catania Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Specializzazione in Genetica Medica Dottorato di Ricerca in Malattie Genetiche dell’Età Centro di Riferimento Regionale per la Diagnosi e Cura delle Malattie Genetiche Teresa Mattina

Integrità del genoma L’integrità del genoma è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione e la riproduzione cellulare. Anche una singola mutazione può impedire o danneggiare gravemente lo sviluppo di un organismo

Nuove mutazioni Frequenza proporzionale alla gravità della patologia Un terzo delle DMD sono nuove mutazioni

Integrità del genoma La cellula possiede meccanismi intrinseci, codificati nel DNA, che le garantiscano la capacità di mantenere l’integrità del genoma riparando i danni del DNA.

Integrità del genoma Plasticità del genoma

Integrità del genoma Un sistema rigido nel mantenimento della sequenza del DNA non permette l’evoluzione. La sopravvivenza delle specie nel lungo periodo richiede la possibilità di adattamento a nuove condizioni fisiche e biologiche dell’ambiente

Integrità del genoma La cellula possiede meccanismi intrinseci al DNA, che le garantiscano la capacità di adattarsi ai cambiamenti ambientali.

Mutazioni e selezione Il DNA è soggetto fisiologicamente al verificarsi continuo di rimaneggiamenti casuali. I rimaneggiamenti del DNA vengono continuamente corretti: ciò tutela dell’integrità del genoma, ma consente l’evoluzione.

Le Mutazioni- la selezione I rimaneggiamenti del DNA che si integrano nel genoma cellulare: mutazioni comportano danno cellulare vengono selettivamente perduti nelle successive generazioni cellulari. conferiscono vantaggio cellulare vengono mantenuti nelle successive generazioni cellulari. I rimaneggiamenti del DNA che si integrano nel genoma cellulare , se comportano danno cellulare tendono ad essere selettivamente perduti nelle successive generazioni cellulari, se invece conferiscono vantaggio cellulare vengono mantenuti nelle successive generazioni cellulari.

Le Mutazioni- la selezione Mutazioni che causano danno cellulare Alterazione delle caratteristiche antigeniche Generazione di anticorpi Attivazione dei macrofagi Ridotta o anomala funzione cellulare Ridotta velocità di replicazione cellulare I rimaneggiamenti del DNA che si integrano nel genoma cellulare , se comportano danno cellulare tendono ad essere selettivamente perduti nelle successive generazioni cellulari, se invece conferiscono vantaggio cellulare vengono mantenuti nelle successive generazioni cellulari. Morte cellulare Invecchiamento tissutale

Le Mutazioni- la selezione Mutazioni che conferiscono vantaggio cellulare Ridotta o anomala funzione cellulare Aumentata velocità di replicazione cellulare Alterazione delle caratteristiche antigeniche Generazione di anticorpi Attivazione dei macrofagi I rimaneggiamenti del DNA che si integrano nel genoma cellulare , se comportano danno cellulare tendono ad essere selettivamente perduti nelle successive generazioni cellulari, se invece conferiscono vantaggio cellulare vengono mantenuti nelle successive generazioni cellulari. Iperplasia Neoplasia

Danno sul DNA

1.1 Danni al genoma umano e attivazione di sistemi di riparo Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Attivazione dei fattori trascrizionali Sistemi di riparo: BER, NER, MMR, HER Apoptosi dei Checkpoints Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Attivazione dei fattori trascrizionali Sistemi di riparo: BER, NER, MMR, HER Apoptosi dei Checkpoints Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Metabolismo Metabolismo Agenti Agenti Errori di UV UV IR IR Virus Cellulare Cellulare Chimici Chimici Replicazione Il genoma umano, contenuto nei cromosomi e nei mitocondri è continuamente esposto all’azione di agenti, esogeni ed endogeni, che lo aggrediscono e lo possono modificare. L’integrità del genoma è fondamentale per la funzionalità e la sopravvivenza cellulare. Tuttavia esso necessita anche di meccanismi che ne garantiscono la intrinseca capacità ad adattarsi con profitto ai cambiamenti ambientali. Questi meccanismi determinano fisiologicamente il verificarsi continuo di rimaneggiamenti casuali della struttura del DNA. Tali rimaneggiamenti, se si stabilizzano, possono essere causa di mutazioni, o se alterano in misura molto sostanziale il DNA nucleare possono essere causa di morte cellulare. Le mutazioni sono, il più delle volte peggiorative, esse infatti determinano cambiamenti in una “ricetta” che si è stabilizzata ed ha raggiunto un suo equilibrio durante il lungo tempo della evoluzione dell’uomo. I rimaneggiamenti del DNA, vengono, pertanto continuamente rimossi grazie a complessi sistemi deputati a tutelare l’integrità del genoma. La costituzione italiana concepita nel 1948 aveva le stesse caratteristiche del genoma: la necessità intrinseca di essere tutelata nella sua integrità, ma insieme, la possibilità, codificata, di cambiamenti. Tali cambiamenti le garantiscono la possibilità di essere rinnovata quando le condizioni lo richiedono. Un importante presupposto alla tutela del DNA sono i tempi delle fasi del ciclo cellulare. Il ciclo cellulare prevede dei momenti di sosta che consentono la riparazione dei danni checkpoint, e prevedono anche che questi tempi si possano allungare nel caso sia necessaria un’azione più prolungata. Il mancato riparo del DNA può determinare alterazione o interruzione della trascrizione, alterazione o interruzione della replicazione del DNA, indurre mutagenesi e/o tossicità cellulare. Danni sul DNA possono determinare mutazioni e sono responsabili di malattie ereditarie, danno del DNA determina invecchiamento cellulare e cancerogenesi (2, 3). Attivazione Attivazione Attivazione Attivazione Attivazione dei dei Sistemi di riparo: Sistemi di riparo: Sistemi di riparo: dei fattori dei fattori dei fattori Apoptosi Apoptosi Apoptosi Checkpoints Checkpoints BER, BER, BER, trascrizionali trascrizionali trascrizionali NER, NER, NER, MMR, MMR, MMR, HER HER HER

DNA RIPARO Arresto ai checkpoints Attivazione sistemi di riparo Induzione di APOPTOSI

Rallentamento del ciclo cellulare e riparo del DNA G1 S G2 M p21 ATM p16 ARF pRb p53 L'integrità genomica è sotto la sorveglianza di un sistema di pathways di regolazione che sono specifici per ciascuna delle differenti fasi del ciclo cellulare e prevengono la riproduzione di cellule il cui DNA è stato danneggiato, garantendo un sufficiente lasso di tempo per la riparazione del danno. Il risultato si ottiene grazie a due opposti meccanismi: riparazione del danno se possibile, eliminazione delle cellule danneggiate che non sono riparabili. Il riparo del DNA e l’apoptosi sono, infatti, i due sistemi essenziali con cui viene mantenuta l’integrità del genoma nell’uomo. La presenza di DNA danneggiato induce l’arresto del ciclo cellulare, e garantisce ad un gruppo di proteine specializzate, un sufficiente lasso di tempo per riparare il danno subito. In caso di danno massivo, si determina suicidio cellulare. In caso di danno le cellule: a)Bloccano il ciclo cellulare b)Attivano i fattori trascrizionali responsabili di modulare l’espressione di geni coinvolti nel riparo; c)Attivano specifici enzimi di riparo del DNA quali BER (riparo per escissione di basi) , NER (riparo per escissione di nucleotidi), MMR (riparo per mismatch) e HER (riparo per ricombinazione omologa); c)Determinano arresto del ciclo cellulare, induzione della apoptosi o “morte cellulare programmata” se livello di danno del DNA è elevato.

I sistemi di checkpoints dipendono da numerosi geni e possono essere parzialmente o totalmente aboliti in seguito a mutazioni che colpiscono i prodotti di specifici geni ( quali ad esempio p53 e ATM). ) I checkpoint in G1 hanno il compito di evitare che il DNA danneggiato venga replicato e rappresentano quindi il sistema di regolazione più importante nelle cellule umane (16). Fulcro di questo pathway è l’accumulo e l’attivazione della proteina p53; due caratteristiche controllate a monte dalle chinasi ATM e ATR. Nelle normali condizioni di crescita cellulare, i livelli di p53 sono bassi, il che è dovuto all’interazione con MDM2, quale target di p53 per l’esportazione nucleare e la degradazione, per via proteosomica, nel citoplasma (17). In seguito ad esposizione, e conseguente danno da IR, l’ATM attiva la chinasi Chk2 (fosforilando in posizione T68) (18), la quale fosforila a sua volta la p53 in posizione S20. La fosforilazione di p53 determina il blocco dell’interazione p53/MDM2 provocandone il suo accumulo. l’ATM dimostra di possedere un secondo controllo: monitora la stabilità di p53 fosforilando direttamente il suo regolatore negativo, MDM2, in S395 (19). Per quanto riguarda l’ATR non è ancora chiaro se essa abbia o meno un ruolo, in vivo, nella fosforilazione di p53 in S20, ma, in vitro, dati sperimentali dimostrano che il risultato può essere raggiunto per fosforilazione di un’altra chinasi: Chk1 (20). La attivazione di p53 segue l’up-regolazione di numerosi geni target coinvolti nella risposta al danno sul DNA (MDM2, GADD45, p21/Cip). In particolare, l’accumulo di p21, una ciclina inibitrice chinasi-dipendente, sopprime l’attività Ciclina E/Cdk2 chinasi attività, traducendosi in un arresto del ciclo cellulare in fase G1 (16, 19). I checkpoints dello stadio S del ciclo cellulare, che monitorano la progressione del ciclo cellulare e il decremento del tasso di sintesi del DNA in seguito ad un danno sul genoma, sono stati gli ultimi ad essere studiati su cellule umane. Studi recenti su cellule di pazienti con cancro e affetti da Atassia-Teleangectasia (AT) o da Sindrome di Nijmegen (NBS) hanno dimostrato una diminuzione del tasso di replicazione del DNA in seguito ad esposizione con IR. Questo fenomeno, definito radio-resistenza a sintesi di DNA (RDS), ha permesso di comprendere il ruolo dei prodotti dei due geni associati (ATM e NBS1 rispettivamente) nel sistema di checkpoint in fase S. L’attivazione di tali proteine avverrebbe attraverso due vie principali e parallele e sempre in presenza di ATM (21-23). Nella prima, in seguito a danno da IR, l’ATM fosforila Chk2 in T68 (24) avviando una fosforilazione/attivazione a cascata, che porta alla disattivazione dei complessi Cdk2/ciclinaA e Cdk2/ciclinaE e quindi alla prevenzione del blocco della sintesi del DNA. La seconda via, provocata sempre dall’esposizione da IR, richiede l’attivazione di ATM, di NBS1 (21-23), del gene per la suscettibilità al cancro alla mammella o BRCA1 e della proteina strutturale cromosomica1 o SMC1: fosforilazioni/inattivazioni o mutazioni in alcuni dei residui di queste proteine saranno sufficienti a spegnere il controllo del checkpoint di fase S (21-23, 25). Dati sperimentali dimostrano, inoltre, che le proteine ATM, NBS1 e BRCA1 sono anche parte di un complesso (grande nell’ordine dei MDa) che include numerose altre proteine del riparo al DNA e fattori di replicazione (26). I checkpoints della fase G2 controllano la sospensione del ciclo cellulare prima che avvenga la segregazione dei cromosomi. L’entrata in mitosi è controllata dalla ciclina chinasi dipendente Cdc2 (16) mantenuta non fosforilata. Sia l’ATM che l’ATR modulano indirettamente lo stato di fosforilazione dei siti (T14 e Y15) di Cdc2 in risposta al danno sul DNA. A differenza degli altri checkpoints, quello in fase G2 è regolato primariamente da ATR (27), mentre l’ATM svolge un ruolo di back-up.

1.1 Danni al genoma umano e attivazione di sistemi di riparo Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Attivazione dei fattori trascrizionali Sistemi di riparo: BER, NER, MMR, HER Apoptosi dei Checkpoints Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Attivazione dei fattori trascrizionali Sistemi di riparo: BER, NER, MMR, HER Apoptosi dei Checkpoints Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Metabolismo Metabolismo Agenti Agenti Errori di UV UV IR IR Virus Cellulare Cellulare Chimici Chimici Replicazione Il genoma umano, contenuto nei cromosomi e nei mitocondri è continuamente esposto all’azione di agenti, esogeni ed endogeni, che lo aggrediscono e lo possono modificare. L’integrità del genoma è fondamentale per la funzionalità e la sopravvivenza cellulare. Tuttavia esso necessita anche di meccanismi che ne garantiscono la intrinseca capacità ad adattarsi con profitto ai cambiamenti ambientali. Questi meccanismi determinano fisiologicamente il verificarsi continuo di rimaneggiamenti casuali della struttura del DNA. Tali rimaneggiamenti, se si stabilizzano, possono essere causa di mutazioni, o se alterano in misura molto sostanziale il DNA nucleare possono essere causa di morte cellulare. Le mutazioni sono, il più delle volte peggiorative, esse infatti determinano cambiamenti in una “ricetta” che si è stabilizzata ed ha raggiunto un suo equilibrio durante il lungo tempo della evoluzione dell’uomo. I rimaneggiamenti del DNA, vengono, pertanto continuamente rimossi grazie a complessi sistemi deputati a tutelare l’integrità del genoma. La costituzione italiana concepita nel 1948 aveva le stesse caratteristiche del genoma: la necessità intrinseca di essere tutelata nella sua integrità, ma insieme, la possibilità, codificata, di cambiamenti. Tali cambiamenti le garantiscono la possibilità di essere rinnovata quando le condizioni lo richiedono. Un importante presupposto alla tutela del DNA sono i tempi delle fasi del ciclo cellulare. Il ciclo cellulare prevede dei momenti di sosta che consentono la riparazione dei danni checkpoint, e prevedono anche che questi tempi si possano allungare nel caso sia necessaria un’azione più prolungata. Il mancato riparo del DNA può determinare alterazione o interruzione della trascrizione, alterazione o interruzione della replicazione del DNA, indurre mutagenesi e/o tossicità cellulare. Danni sul DNA possono determinare mutazioni e sono responsabili di malattie ereditarie, danno del DNA determina invecchiamento cellulare e cancerogenesi (2, 3). Attivazione Attivazione Attivazione Attivazione Attivazione dei dei Sistemi di riparo: Sistemi di riparo: Sistemi di riparo: dei fattori dei fattori dei fattori Apoptosi Apoptosi Apoptosi Checkpoints Checkpoints BER, BER, BER, trascrizionali trascrizionali trascrizionali NER, NER, NER, MMR, MMR, MMR, HER HER HER

1.1 Danni al genoma umano e attivazione di sistemi di riparo Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Attivazione dei fattori trascrizionali Sistemi di riparo: BER, NER, MMR, HER Apoptosi dei Checkpoints Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Attivazione dei fattori trascrizionali Sistemi di riparo: BER, NER, MMR, HER Apoptosi dei Checkpoints Esposizione ad agenti mutageni Metabolismo Cellulare UV IR Agenti Chimici Errori di Replicazione Metabolismo Metabolismo Agenti Agenti Errori di UV UV IR IR Virus Cellulare Cellulare Chimici Chimici Replicazione Il genoma umano, contenuto nei cromosomi e nei mitocondri è continuamente esposto all’azione di agenti, esogeni ed endogeni, che lo aggrediscono e lo possono modificare. L’integrità del genoma è fondamentale per la funzionalità e la sopravvivenza cellulare. Tuttavia esso necessita anche di meccanismi che ne garantiscono la intrinseca capacità ad adattarsi con profitto ai cambiamenti ambientali. Questi meccanismi determinano fisiologicamente il verificarsi continuo di rimaneggiamenti casuali della struttura del DNA. Tali rimaneggiamenti, se si stabilizzano, possono essere causa di mutazioni, o se alterano in misura molto sostanziale il DNA nucleare possono essere causa di morte cellulare. Le mutazioni sono, il più delle volte peggiorative, esse infatti determinano cambiamenti in una “ricetta” che si è stabilizzata ed ha raggiunto un suo equilibrio durante il lungo tempo della evoluzione dell’uomo. I rimaneggiamenti del DNA, vengono, pertanto continuamente rimossi grazie a complessi sistemi deputati a tutelare l’integrità del genoma. La costituzione italiana concepita nel 1948 aveva le stesse caratteristiche del genoma: la necessità intrinseca di essere tutelata nella sua integrità, ma insieme, la possibilità, codificata, di cambiamenti. Tali cambiamenti le garantiscono la possibilità di essere rinnovata quando le condizioni lo richiedono. Un importante presupposto alla tutela del DNA sono i tempi delle fasi del ciclo cellulare. Il ciclo cellulare prevede dei momenti di sosta che consentono la riparazione dei danni checkpoint, e prevedono anche che questi tempi si possano allungare nel caso sia necessaria un’azione più prolungata. Il mancato riparo del DNA può determinare alterazione o interruzione della trascrizione, alterazione o interruzione della replicazione del DNA, indurre mutagenesi e/o tossicità cellulare. Danni sul DNA possono determinare mutazioni e sono responsabili di malattie ereditarie, danno del DNA determina invecchiamento cellulare e cancerogenesi (2, 3). Attivazione Attivazione Attivazione Attivazione Attivazione Anomalie della riparazione del DNA dei dei Sistemi di riparo: Sistemi di riparo: Sistemi di riparo: dei fattori dei fattori dei fattori Apoptosi Apoptosi Apoptosi Checkpoints Checkpoints BER, BER, BER, trascrizionali trascrizionali trascrizionali NER, NER, NER, MMR, MMR, MMR, HER HER HER

DNA RIPARO

Difetti del DNA RIPARO Invecchiamento precoce dei tessuti a rapida proliferazione Cute Mucose Linfociti Degenerazione tessuti SNC Neoplasie

Difetti del DNA RIPARO S. Bloom

Acrosteolisi?

Atassia telangectasia

Assoluta necessità di standardizzazione Metodi di studio Studio di crescita clonale Studio dei cromosomi Studio dei micronuclei COMET Assoluta necessità di standardizzazione e di controlli

Metodi di studio cromosomico Ricerca delle rotture cromosomiche/cromatidiche spontanee Ricerca delle rotture cromosomiche/cromatidiche indotte Analisi degli scambi fra cromatidi fratelli SCE Analisi citogenetica costituzionale Studio cromosomico del tessuto neoplastico

Metodi di studio cromosomico Ricerca delle rotture cromosomiche/cromatidiche spontanee o indotte su 100 metafasi Indice mitotico Percentuale di cellule con rotture Numero di rotture per cellula

Metodi di studio cromosomico Ricerca delle rotture cromosomiche/cromatidiche spontanee o indotte su 100 metafasi Conta delle rotture per cellula Numero di rotture/100

Conta delle rotture per cellula Percentuale di cellule con rotture

Conta delle rotture per cellula Percentuale di cellule con rotture

Conta delle rotture per cellula Percentuale di cellule con rotture

Tipo di danno cellulare

25 CGG-CGG-CGG-CGG CGG-CGG-CGG CGG-CGG-CGG-CGG CGG-CGG- CGG-CGG-CGG

SCE

SCE

SCE Ciclo cellulare I divisione II divisione III divisione

SCE

Tipo di danno cellulare 25

Metodi di studio cromosomico Analisi degli scambi fra cromatidi fratelli SCE Rotture normali Rotture aumentate SCE normali SCE aumentati

Metodi di studio cromosomico Analisi citogenetica costituzionale Studio cromosomico del tessuto neoplastico

Cariotipo standard

Riarrangiamenti clonali

FISH Denaturazione Scelta della sonda Ibridazione Lettura

SONDE FISH Yac: 100-150kb-2Mb Bac: fino a 330kb di DNA Cosmidi: fino a 40kb di DNA Fagi: fino a 14-15kb di DNA Plasmidi: fino a 4-5kb di DNA

Sonde per FISH Painting: identificare materiale da uno specifico cromosoma

FISH

M-FISH Immagini catturate separatamente per ciascun fluorocromo utilizzando filtri ottici modificati Immagini elaborate da uno specifico software

SKY Acquisizione delle immagini: microscopio ad epifluorescenza, immagini charge-coupled device (CCD) e spettroscopio Fourier Misurazione dell’intera emissione dello spettro con una singola esposizione di tutte le immagini

Sono particolarmente utili per: SKY-M-FISH Sono particolarmente utili per: Evidenziare traslocazioni Identificare marker cromosomici, regioni colorate in modo omogeneo, duplicazioni cromosomiche Individuare alcuni riarrangiamenti complessi

Array CGH

Array CGH

M-CGH Array-CGH

Metodi di studio Studio dei micronuclei

Metodi di studio cromosomico COMET

Analisi con microscopio a fluorescenza TEST COMET Cellule inglobate in agarosio su vetrino Lisi delle cellule in situ Elettroforesi su vetrini Colorazione del DNA Analisi con microscopio a fluorescenza Diametro della testa circa 40 m Preparazione dei vetrini : sospendere le cellule ( 3-5 x 103) in agarosio low melting e deporle su un vetrino portaoggetti Lisi: lisi delle membrane cellulari, dell’RNA e delle proteine a pH alcalino (10-12) Srotolamento del DNA ( mantenendo il minigel per 20-30 min. a pH 12.5-13.0 Elettroforesi a pH alcalino (12.8-13.4) Neutralizzazione “Staining” con etidio bromuro Analisi dei risultati al microscopio a fluorescenza

Strumentazione per l’analisi del danno al DNA mediante COMET ASSAY B LA PRESENZA DI TAGLI E/O ADDOTTI SUL DNA INTERFERISCE CON IL TRASCINAMENTO DELLO STESSO DURANTE LA CORSA ELETTROFORETICA FACENDOGLI ASSUMERE L’ASPETTO DI UNA COMETA ( Comet assay ). LA LUNGHEZZA DELLA CODA E L’INTENSITA’ DELLA FLUORESCNZA IN ESSA PRESENTE SONO INDICATORI DELLA GRANDEZZA E DELLA TIPOLOGIA DEL DANNO AL DNA”. Microscopio a fluorescenza collegato con il computer che analizza i risultati tramite software opportuno A: Esempio di “cometa” B: Cellula con DNA integro

TEST COMET

APPLICAZIONI del TEST COMET Studi genotossici Riparazione del DNA Analisi di apoptosi Biologia dei radicali liberi Tossicologia alimentare Biomonitoraggi Indagini cliniche Analisi del ciclo cellulare VERSIONE ALCALINA VERSIONE NEUTRA

Comet Neutra + Bleo

DNA in equilibrio Predisposizione Genetica Checkpoint Enzimi del DNA riparo Metabolismo Fattori ambientali Metabolismo cellulare Agenti fisici UV, RI, Agenti chimici: ossidanti, benzene, fumo di sigaretta, caffè, farmaci Virus Carenze vitaminiche (vit. C, acido folico)

Genotipo Fenotipo Ambiente DNA Replicazione Riparo Trascrizione RNA Traduzione Riparo Recettori Proteine RNA Ambiente Fenotipo

Fattori ambientali ROMA (ANSA 11.05.06) - Sono circa 14.000 l'anno i casi stimati di tumore tra gli adolescenti e i giovani adulti (tra 15 e 39 anni) in Italia, ……..………….crescono i tumori in qualche modo legati ai cattivi stili di vita, a partire dal fumo di sigaretta e la mania per l'abbronzatura.