Dipartimento di Scienze Biomediche - Sezione Embriologia Medica - Università di Catania Corso di Istologia ed Embriologia – polo B - Testi Consigliati: Istologia di V. Monesi Ed. Piccin Larsen - Embriologia Umana - Ed. Gnocchi o Barbieri - Carinci – Embriologia – Casa Editrice Ambrosiana Dr. Imbesi Rosa

- micrometro (mm) = 10-3 mm - milligrammo (mg) = 10-3 g Materia Vivente= Tutto ciò che ha la capacità di riprodursi o di replicarsi UNITA’ DI MISURA DI LUNGHEZZA: - micrometro (mm) = 10-3 mm - nanometro (nm) = 10 -3 mm - Angstrom (Å) = 10 -1 nm UNITA’ DI PESO: - milligrammo (mg) = 10-3 g - microgrammo (mg) = 10-6 g - nanogrammo (ng) = 10-9 g - picogrammo (pg) = 10-12 g Dalton = unità di massa molecolare Corrisponde al peso dell’atomo di idrogeno considerato come unità

LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE DELLA SOSTANZA VIVENTE Virus, viroidi e prioni Cellula vegetale Batteri Alghe Cellula animale Procarioti batterio unicellulari Protozoi Protofiti Eucarioti virus ribosoma pluricellulari Proteina globulare aminoacidi atomo

La più piccola unità vivente CELLULA La più piccola unità vivente Cellula Cellula Cellule Cellule + matrice extracellulare TESSUTO Porzione di materia vivente con aspetto omogeneo presente con caratteristiche simili in varie sedi del corpo TESSUTO ISTOLOGIA Studio dei tessuti

distanza minima alla quale due punti possono essere distinti come entità separate POTERE DI RISOLUZIONE Occhio umano 0.4 nm 200 nm (0.2mm) 10 nm PR: 100 mm (0.1 mm)

MICROSCOPIA OTTICA Consistenza Conservazione della struttura INCLUSIONE FISSAZIONE

Si fanno 2 – 3 cambi di xilolo per eliminare tutto l’alcool MICROSCOPIA OTTICA Da pochi minuti ad 1-2 giorni 1- 2 ore per gradazione Diafanizzazione 1- 2 ore per recipiente Si fanno 2 – 3 cambi di xilolo per eliminare tutto l’alcool Formella Qui viene versata la paraffina fusa La paraffina viene versata all’interno di formelle di plastica o rame di seguito, abbastanza velocemente, vengono allineati, i pezzi da includere

Si fanno 2-3 cambi per eliminare tutto il solvente MICROSCOPIA OTTICA Inclusione 6-24 ore in totale Si fanno 2-3 cambi per eliminare tutto il solvente Taglio Il taglio delle sezioni è effettuato utilizzando il microtomo

Qui i vetrini possono rimanere per un certo tempo MICROSCOPIA OTTICA Montaggio Colorazione e montaggio Qui i vetrini possono rimanere per un certo tempo 2’ per ogni recipiente 20-30” per alcool 5’ -10’ Ematossilina 5’ 1-2’ per X Eosina 1’ Montaggio

INCLUSIONE PER CONGELAMENTO Svantaggi Vantaggi Maggiore rapidità Migliore conservazione delle caratteristiche chimiche Danneggiamento della morfologia dei tessuti TAGLIO

MICROSCOPIA OTTICA FASI, OCCORRENTE, SCOPI E TEMPI NECESSARI PER L'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO di organi o tessuti da studiare PRELIEVO forbici, pinzette, bisturi, lamette, piano di sughero o in materiale plastico l’operazione va eseguita nel più breve tempo possibile Impedire la degenerazione dei tessuti per mantenere il più possibile inalterato il quadro strutturale dei tessuti FISSAZIONE Formalina neutra al 10% Il tempo di soggiorno dei pezzi nel fissativo varia da poche ore a 1-2 giorni Rendere il pezzo di consistenza tale da poter essere affettato allo spessore voluto (5-7 mm) INCLUSIONE Serie di alcooli – Solvente del mezzo includente – Mezzo includente – Stufa a 56-60°C Da alcune ore a 1-2 giorni Affettare il pezzo in modo da poter essere osservato al microscopio TAGLIO Microtomo Disporre le sezioni su vetrini MONTAGGIO Vetrini portaoggetto - Piastratermostata Permettere l’osservazione della sezione al microscopio COLORAZIONE Coloranti Proteggere le sezioni e migliorare l’osservazione al micorscopio MONTAGGIO Vetrini coprioggetto - Montante

Alcuni esempi di colorazioni Ematossilina/Eosina Porzioni cellulari basofile Porzioni cellulari acidofile Ematossilina Eosina Colorante basico che ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine) Colorante acido che ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol) Esiste una grande varietà di coloranti Alcuni esempi di colorazioni Questa tabella ne evidenzia alcuni dei più comuni PAS (Acido Periodico Schiff) Dimostrazione della presenza di carboidrati. Impregnazione argentica o con oro Tali strutture sono colorate in magenta Per processi cellulari e fibre delicate comprese quelle nervose Tricromica Utilizzata per evidenziare le fibre connettivali May-Grünwald-Giemsa Per l’esame di strisci di sangue e per distinguerle da quelle muscolari Sudan black o osmio Per lipidi/mielina I lipidi non incorporano coloranti acquosi e di midollo osseo

Come si osserva il campione? Attraverso un buon microscopio ottico Fotografandolo Interpretare il campione !!!! Sezione longitudinale Sezione trasversale Sezione obliqua

Allestimento di uno striscio COLORAZIONE

MICROSCOPI A contrasto di fase Microscopio ottico A fluorescenza Permette di osservare cellule e tessuti a fresco MICROSCOPI A contrasto di fase A interferenza Fornisce dati quantitativi Microscopio ottico A fluorescenza Confocale E’ in grado di rivelare e localizzare molecole fluorescenti E’ in grado di mettere a fuoco piani diversi di un preparato

MICROSCOPIA ELETTRONICA TEM SEM Membrana cellulare RER Granuli di secrezione Mitocondri Apparato di Golgi Nucleo Entrambi basati sull’uso di un fascio di elettroni SEM: basato sul principio di una immagine riflessa derivante dal rimbalzare degli elettroni sulla superficie del campione permette la visione tridimensionale della superficie di cellule e tessuti TEM: Immagine derivata dall’attraversamento delle strutture biologiche da parte degli elettroni permette lo studio della morfologia subcellulare

Microscopio ottico e microscopio elettronico a confronto P.R. TEM: 2Å Catodo: filamento Anodo Quando usare il microscopio elettronico? La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico Condensatore P.R. Occhio: 0.2 mm = 200 mm Preparato P.R. M. Ottico: 2000 Å = 200 nm oculare Obiettivo Proiettore Obiettivo Sezione istologica Lente del condensatore Schermo fluorescente Sorgente luminosa: lampada

PREPARAZIONE DI CAMPIONI BIOLOGICI PER TEM 1. Fissazione Glutaraldeide tamponata a pH 7.2-7.8 2. Postfissazione Tetrossido di osmio L’osmio agisce anche da “colorante” sia perché si lega come osmio ridotto alle lipoproteine e ad altri costituenti delle cellule sia perché l’osmio, a causa del suo elevato numero atomico, aumenta la diffrazione degli elettroni da parte dei costituenti cellulari, accentuandone il contrasto 3. Disidratazione Passaggi in soluzioni crescenti di etanolo Lama di diamante o di vetro 4. Inclusione Resine epossidiche Ultramicrotomo 5. Taglio Sezioni che galleggiano in acqua 6. Montaggio Retino Vetrino portaoggetto Spessore da 40 a 100 nm 7. Colorazione Coloranti elettronici Blu di toluidina 8. Visualizzazione TEM Microscopio ottico Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

TEM SEM Catodo: filamento Anodo Condensatore Preparato Scanner Obiettivo Proiettore Schermo fluorescente TEM SEM Scanner Fascio di elettroni Amplificatore elettronico SCHERMO Elettroni secondari Preparato

MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE Minore potere di risoluzione rispetto al TEM Vediamo di saperne un po’ di più… Usato per studiare la superficie cellulare Consente di valutare il rilievo degli oggetti Fornisce una immagine tridimensionale della superficie del campione Il campione non viene tagliato

Come si prepara il campione per l’osservazione al SEM? Acquisizione del campione Il campione deve essere trattato con cura per non danneggiare la superficie Fissazione e Disidratazione No inclusione Il campione viene poggiato su un supporto Ricoperto con un metallo elettronconducente Visualizzato Fotografato Analizzato ai raggi X

Riassumendo …… *** MO TEM SEM SCHERMO FLUORESCENTE Immagine riflessa 1 1. Sorgente per l’illuminazione TEM SEM 2 2. Lente condensatore 3 3. Preparato 4 4. Obiettivo Filamento elettronico ad alta tensione lampadina 5 5. Oculare 6 6. Proiettore Lente di vetro Lente elettromagnetica Vetrino portasezione Retino portasezione 7. Sistema di deflessione del fascio Lente di vetro Lente elettromagnetica Schermo TV *** 8. Fotomoltiplicatore Blocchetto metallizzato SCHERMO FLUORESCENTE Immagine riflessa OCCHIO

Istologia “funzionale” Istocitochimica - Si prefigge di localizzare particolari molecole impiegando reazioni chimiche specifiche Immunoistochimica - Permette di dimostrare la presenza di specifiche sostanze nei tessuti utilizzando anticorpi Citometria a flusso L’istologia moderna non si limita all’osservazione descrittiva degli aspetti morfologici e strutturali di base di cellule e tessuti. Esistono numerose tecniche che consentono di rispondere a quesiti su aspetti funzionali della composizione di un tessuto - Permette di misurare alcuni parametri morfologici Autoradiografia - Permette di approfondire le conoscenze della fisiologia cellulare Colture cellulari - Permette studio e osservazione delle cellule viventi Biologia molecolare - NORTHERN BLOTTING - Permette di definire quali geni sono espressi da un tipo cellulare o tessuto IBRIDAZIONE In Situ - Permette di localizzare RNAm per specifiche proteine