Emoglobinuria Parossistica Notturna Università degli Studi di Torino Corso di Laurea Specialistica Biotecnologie Mediche Immunologia Molecolare Emoglobinuria Parossistica Notturna Genuardi Elisa 22 novembre 2007

L’Emoglobinuria Parossistica Notturna (PNH) è una rara patologia acquisita caratterizzata da un’espansione clonale non maligna di una o più cellule staminali ematopoietiche, causata da mutazioni somatiche a livello del gene PIGA sul cromosoma Xp22 [2]

…Un po’ di Storia… 1866: Sir William Gull descrisse il caso di un giovane paziente con “ematinuria” 1882: Strubin, riconobbe Hb come pigmento delle urine nei casi descritti 1928: Enneking conia il nome di Emoglobinuria Parossistica Notturna 1930: Ham osserva che i globuli rossi nella PNH sono sensibili alla lisi mediata dal complemento 1956: deficit di AChE negli eritrociti di pz con PNH 1970-1990: identificazione delle proteine transmenbrana mancanti nei globuli rossi si pz con PNH con un ruolo nella lisi complemento-mediata 1993: Kinoshita isola il gene PIG A come responsabile delle caratteristiche molecolari dell’EMOGLOBINURIA PAROSSISTICA NOTTURNA

…PIG A e biosintesi delle GPI anchor proteins… [5] http://www.ncbi.nlm.nih.gov

…le Conseguenze…. [5]

…CD 55 e CD 59… CD59 CD55 http://asheducationbook.hematologylibrary.org

Azione su C3-C5 convertasi inibisce MAC [6] INIBIZIONE ATTIVITA’ FIBRINOLITICA e INDOTTA ESPRESSIONE ATTIVITA’ PROTROMBINICA piastrine Deficit u-PAR Microvescicolazione complessi MAC e lisi cellule

…Caratteristiche Cliniche… Emoglobinuria Trombosi Anemia Disfagia Dolori addominali Spasmi esofagei Impotenza maschile http://www.hmds.org.uk http://www.thecrookstoncollection.com

Adattata da Pasquinelli F.”Diagnostiche e Tecniche di Laboratorio” …Diagnosi… TEST DI HAM studia la sensibilità delle emazie al complemento in mezzo acido a ph 6.5 e a 37°C TEST AL SACCAROSIO studia l’anomala sensibilità al complemento delle emazie in un mezzo a debole forza ionica LIMITI Non sensibile No quantificativo Falsi negativi Adattata da Pasquinelli F.”Diagnostiche e Tecniche di Laboratorio”

CITOFLUORIMETRIA Permette la quantificazione Tecnica sensibile (minimo 0,003% cells GPI -AP-) Utilizzo di MoAb che riconoscono GPI anchor proteins (anti-CD55 e anti CD 59) e Moab verso marker specifici delle linee cellulari [8]

(Fluorescently Labelled Inactive variant of the Protein Aerolysin) FLAER (Fluorescently Labelled Inactive variant of the Protein Aerolysin) [6] Alta affinità e specificità per “l’ancora” delle GPI-APs Identifica, in base alla % cloni PNH, pazienti a rischio di trombosi La % di granulociti è indice di dolori addominali, grado di emolisi, spasmi orofagei e disfunzioni erettili.

…MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO… [2] …MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO…

…MOISACISMO CELLULARE SOMATICO… Osservato con test di sensibilità alla lisi complemento-mediata e confermato con esperimenti di citofluorimetria e FLAER Pazienti con PNH possono presentare 3 popolazioni di GR: PNH I  normali, GPI-APs presenti PNH II  deficit parziale di GPI-APs PNH III  deficit totale La gravità della patologia è molto influenzata dalla percentuale di cellule appartenenti alle 3 popolazioni!! [1]

???MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO???? [9] Gene PIG A(6 esoni) Esone 1 molto corto, non è tradotto Esone 2 codifica per gran parte del trascritto Proteina di 54 kD, 484 aa con una sequenza idrofobica di 27 aa nei pressi del C- terminale [1] Xp22 Modelli in vivo: KO Pig A  letale a livello embrionale KO condizionali emolisi intravascolare (conferma aspetti clinici)

Donne e uomini: stessa frequenza di PNH Mutazioni somatiche su PIG A HSC XX Inattivazione X HSC XY Mutazioni somatiche su PIG A PNH

… Le Mutazioni … INSERZIONI E DELEZIONI: Mutazioni missense (cambio aa) Mutazioni nonsense (stop codon prematuro) Mutazioni su siti di splicing (lunghezza mRNA e stabilità) … Le Mutazioni … 1995 Bessler et al analizzano il cDNA di PIG A in quattro linee cellulari GPI-AP- DELEZIONE regione promoter (CAAT motifs), esone 1 e parte dell’introne 1 determina una diminuita ma non assente espressione delle GPI-APs [10] La perdita del trascritto funzionante è dovuta a exon skipping dell’esone 2

2005 Hu et al. osservano mutazioni a livello di PIG A anche in cellule di sani Policlonali Avvengono su cellule che non si autorinnovano [11]

? ANEMIA APLASTICA PNH MIELODISPLASIE Molti studi clinici individuano in pazienti con patologie ematologiche una percentuale di cellule GPI-APs - ? ANEMIA APLASTICA PNH MIELODISPLASIE P.S: anche i sani hanno mutazioni somatiche in PIG A

Riconosciuto come non self REAZIONE AUTOIMMUNITARIA HSC Antigene self ??? GPI-AP??? ESCAPE ALLA REAZIONE IMMUNITARIA Ma Deficit di GPI-APs EMOLISI e PNH!!!! HSC PIG A mut

IL CLONE PNH NON È UNO STATO PRELEUCEMICO!!! … DUE REQUISITI… Presenza di mutazioni a livello di PIG A Presenza di un microambiente idoneo, da cui le cellule GPI-APs – possono trarre un vantaggio selettivo alla crescita ( escape alla reazione autoimmunitaria) Nei pazienti con PNH le mutazioni a carico del gene PIG A sono CLONALI ( colpiscono la stessa regione del gene) Il clone che trae maggior vantaggio alla crescita dal microambiente “autoimmune”, prolifera senza limiti per ripristinare una normale emopoiesi Telomere Restriction Fragments di pz con PNH è molto più corto rispetto ai sani evidenza di una spiccata proliferazione A livello periferico si riflette la mancanza delle GPI-APs IL CLONE PNH NON È UNO STATO PRELEUCEMICO!!!

Terapia mirata ad ogni singola caratteristica clinica La PNH è una rara patologia acquisita caratterizzata da un’espansione clonale non maligna di una o più cellule staminali ematopoietiche Classical PNH PNH associata a bone marrow failure Subclinical PNH (nessun segno clinico di emolisi) … un po’ di dati… Sono affetti da PNH 8000-10000 persone nel Nord America e Europa Occidentale Età di insorgenza: 30-40 anni (10% dei casi insorge a 21 anni o meno) 50% dei pz muore per trombosi, infezioni (America – Europa occidentale) o neoplasie ematologiche (Asia e paesi Orientali) Sopravvivenza stimata 10 anni Terapia mirata ad ogni singola caratteristica clinica

(against complement C5) …TERAPIA… CORTICOSTEROIDI emolisi cronica ANDROGENI in possibile combinazione con STEROIDIinibizione del complemento SOMMINISTRAZIONE FERRO e FOLATI/TRASFUSIONI  anemia (attenzione alle patologie da sovraccarico di ferro e incompatibilità sistema ABO) WARFARINA trombosi Ma il futuro è…. ECULIZUMAB (against complement C5)

…References… Parker C.J.,” The pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Experimental Hematology 35, 523(2007) Luzzatto L.,” Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: an acquired genetic disease with somatic-cell mosaicism”, Current Opinion in Genetics & Development 16,317(2006) Boccuni P. et al, “Glycosyl phosphatidylinositol (GPI)-anchored molecules and the pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Critical Reviews in Oncology:Hematology 33, 25 (2000) Dacie J.V., Lewis S.M.,”Paroxymal Nocturnal Haemoglobinuria: clinical manifestations, haematology, and nature of disease”, Ser.Haemat vol V,3 (1972) Meletis J., Terpos E.,”Recent insights into the pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Med Sci Monit, 9(7),161 (2003) Savage W.,Bodsky R.A., “New insight into paroxymal nocturnal haemoglobinuria”, Haematology, 12(5),371(2007) Moyo V.M. et al,” Natural history of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria using modern diagnostic assays”, British Journal of Haematology, 126, 133 (2004) Richards S.J. et al, Recent advances in the diagnosis, monitoring, and management of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Cytometry Part B (Clinical Cytometry), 72B,291(2007) Rosse W.F., Ware R.E., “The molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Blood, No 9, Vol 86, 3277(1995) Bessler M. et al, “Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) is caused by somatic mutations in the PIG-A gene”, The EMBO Journal, vol. 13, 110(1994) Hu R. et al, “PIG-A mutations in normal hematopoiesis”, Blood, n°10, vol105, 3848(2005)

Johnson R.J., Hillmen P.,” Paroxymal nocturnal haemoglobinuria: nature’gene therapy”, J Clin Pathol: Mol Pathol, 55,145 (2002) Parker C. et al, “Diagnosis and management of paroxymal nocturnal haemoglobinuria”, Blood, n°12, volume 106, 3699 (2005) Karadimitris A. et al,” Severe telomere shortening in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria affects both GPI and GPI hematopoiesis”, Blood, n°13, volume 102, 514 (2003) Parker J. et al, “Eculizumab”, Nature Review-Drug Discovery, 6,515 (2007)