Polimorfismi, mutazioni e metodi per evidenziarli

Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi DNA satellite Unità da 5 a 200 bp. Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi

Polimorfismi del DNA: microsatelliti Minisatelliti Unità fino a 5 bp. Segmenti lunghi fino a 25 kb Allele A TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG Allele B TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG Microsatelliti Unità < 4bp. Segmenti lunghi fino150 bp Allele A TACCAAGGTACACACACGGTACCATGG Allele B TACCAAGGTACACACACACGGTACCATGG Allele C TACCAAGGTACACACACACACGGTACCATGG Allele D TACCAAGGTACACACACACACACGGTACCATGG

Perché i microsatelliti sono così polimorfici?

Polimorfismi del DNA: SNP (single nucleotide polymorfism) ---ATGTTGAAGTTCAAGAATTCTGTGCGGAAC--- ---ATGTTGAAGTTCAAGTATTCTGTGCGGAAC--- ---ATGTTGAAGTTCAAGCATTCTGTGCGGAAC--- ---ATGTTGAAGTTCAAGGATTCTGTGCGGAAC---

Come evidenziare i polimorfismi? RFLP= restriction fragment length polymorphism

Gli RFLP possono evidenziare sia polimorfismi dovuti a mutazione di singoli nucleotidi (che fanno comparire o scomarire siti di restrizione) sia polimorfismi di tipo minisatellite (VNTR = Variable Number of Tandem Repeats)

I polimorfismi di tipo microsatellite possono essere evidenziati mediante PCR (STR = Short Tandem Repeat) Due vantaggi principali rispetto agli RFLP: più facili da evidenziare (PCR), e molto più polimorfici (elevato tasso di eterozigosità)

I marcatori polimorfici (soprattutto gli STR) sono stati estremamente utili per ottenere una prima mappa globale del genoma umano

La mappa genetica ottenuta con i marcatori è fondamentale per mappare i geni responsabili di patologie umane (positional cloning) La posizione di un gene malattia viene definita valutando la frequenza di ricombinazione del carattere fenotipico rispetto ai marcatori polimorfici disponibili (rivedere il concetto di linkage dalla genetica)

I marcatori polimorfici sono molto usati nelle indagini di medicina legale (identificazionie di indivudui, attribuzione di paternità/maternità). In passato si usavano gli RFLP, oggi soprattutto gli STR (Test del DNA standard messo a punto dall’FBI= analisi di 13 marcatori STR altamente polimorfici). L’uso della PCR consente di fare diagnosi su tracce. Quando il materiale biologico è troppo scarso o di qualità scadente, può essere utile analizzare i polimorfismi del DNA mitocondriale (moltissime copie per cellula)

Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi Amplificazione della regione mediante PCR con oligonucleotidi fiancheggianti il punto di interesse e successiva digestione con enzimi di restrizione

Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi L’utilizzo combinato della PCR e dell’analisi di restrizione permette di diagnosticare specifiche mutazioni molto più facilmente che con il Southern Blot

Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi Amplificazione, mediante PCR, dot-blot e ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici b A b S P1 P1 P2 P2 PCR

Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi Amplificazione, mediante PCR, dot-blot e ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici

Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi Amplificazione allele-specifica

Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi Amplificazione (di DNA genomico o cDNA) e sequenziamento diretto.

L’utilizzo simultaneo della PCR e di traccianti fluorescenti consente l’analisi simultanea (multiplex) di moltissimi polimoprfismi

Diagnosi genetica pre-impianto

Diagnosi genetica pre-impianto

Diagnosi genetica pre-impianto Quali i vantaggi, e quali i pericoli? Possibile già oggi per malattie monogeniche per cui sia nota la mutazione In futuro, almeno in teoria, è probabile che questa tecnica, in combinazione con l’analisi simultanea di moltissimi polimorfismi, possa permettere una valutazione di tratti genetici complessi. Quali i vantaggi, e quali i pericoli?