Corso di Biologia Molecolare - Laurea Triennale Corso di Biologia Molecolare - Laurea Triennale MODULO DI REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE 1) Metodiche per lo studio dell’RNA (trascrizione in vitro, Northern blot, interazioni nnRNA-proteine) 2) Produzione delle estremità 3’ degli mRNA - La poliadenilazione e U7 snRNA 3) Lo splicing e i piccoli RNA nucleari (regolazione di splicing – L32) 4) RNA interference e miRNA Materiale didattico: Materiale disponibile su: http://www.gbm.uniroma1.it/informazioni/elencoDocenti.php Testi consigliati: Biologia Molecolare – R.F. Weaver – Mc Graw Hill - Biologia Molecolare della cellula –Lodish et al. Ed. Zanichelli Il Gene - B. Lewin, Ed. Zanichelli

Quale è la differenza tra l’RNA ed il DNA? L’ RNA ha l’uracile al posto della timina L’ RNA ha il ribosio al posto del desossiribosio L’ RNA è a singola elica, rispetto alla doppia elica del DNA, ma può strutturarsi in conformazioni a doppia elica molto complesse 2

Differenze tra DNA e RNA CH3 timina Differenze tra DNA e RNA L’ RNA ha l’uracile al posto della timina 3

DNA RNA Base azotata Base azotata 5’ Desossi-ribosio 5’ ribosio P O OH 4

• mRNA splicing e la traduzione sono ribo-enzimi Queste differenze hanno delle implicazioni funzionali ed evolutive Le prime molecole “viventi” dovevano essere in grado di replicare e svolgere funzioni Agli inizi degli anni ‘80 furono scoperti RNA che erano in grado di ricopiare altre molecole di RNA e che svolgevano funzioni catalitiche simili a quelle svolte dagli enzimi proteici • mRNA splicing e la traduzione sono ribo-enzimi • parte del genoma deriva da elementi ad RNA • l’RNA regola la stabilità di altre molecole di RNA

L’RNA è in grado di replicare se stesso ? RNA RNA proteine TWO GOALS. Want to teach you something medically useful, and to instill some respect for RNA as a molecule. Above all, want to remind you that we ourselves are made of RNA and protein, not just protein (and of course lipids, carbohydrates, etc.) and that many key parts of our cellular machinery have RNA as a central, indeed catalytic component. Mondo ad RNA

Cech dimostrò che l’RNA poteva polimerizzare legami fosfodiesterici ricopiando un templato di RNA Solo i polimeri di RNA hanno mostrato capacità replicativa. catalytic (+) strand template (–) strand Se l’RNA può essere sia enzima che stampo, e l’RNA può replicare se stesso….ecco la prima molecola “vivente”! catalytic (+) strand copies unfolded template (–) strand two catalytic (+) strands and original template (–) strand

Protogenoma molecole di RNA autoreplicanti capaci di dirigere semplici reazioni biochimiche

Verso un mondo a DNA sintesi di deossiNTP da riboNTP - sintetasi mutanti che incorporavano dNTP (retrotrascrittasi) - prime sintesi di DNA vantaggi del DNA - desossiribonucleotidi più stabili perché manca l’OH in 2’ sullo zucchero OH H OH

polyadenylated pre-mRNA Espressione genica negli eucarioti transcription START site exons gene upstream elements promoter elements introns TRANSCRIPTION CAPPING pre-mRNA m7G SPLICING POLYADENYLATION polyadenylated pre-mRNA m7G AAAAAAAAAn nucleus mature mRNA m7G AAAAAAAAAn TRANSPORT cytoplasm TRANSLATION 10

La regolazione post-trascrizionale Per tanti anni lo studio della regolazione dell’espressione genica si è concentrato sul controllo trascrizionale. Il motivo risiede nel fatto che i primi geni isolati codificavano per prodotti espressi nel differenziamento terminale (prevalentemente sotto controllo trascrizionale - globine, immunoglobuline, ovalbumina) Quando si sono isolati i geni housekeeping o quelli finemente modulati nel differenziamento cellulare ci si è accorti che molta parte della regolazione dell’espressione genica avveniva a livello post-trascrizionale

Perché studiare l’RNA? Regolazione post-trascrizionale splicing/processing sn-snoRNAs poliadenilazione/formazione 3’ snRNAs modificazioni (CH3,U) snoRNAs trasporto traduzione miRNAs editing gRNAs stabilità siRNAs nucleus cytoplasm 12

La maggior parte dei trascritti del genoma sono RNA non codificanti per proteine large - rRNA 18+28S Xist small - 5S rRNA traduzione tRNA traduzione snRNAs splicing snoRNAs modificaz./process. rRNA scRNAs controllo traduzionale gRNAs editing piRNAs stabilità del genoma miRNAs controllo traduzionale siRNAs stabilità dell’RNA rasiRNAs silenziamento trascriz. …?…. …… …… …?… …… 13

Metodi di studio dell’RNA Trascrizione in vitro Northern blot Preparazione di estratti cellulari Studio delle interazioni tra RNA e proteine 14

Trascrizione in vitro dell’RNA Procedura -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6) -Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*) -Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA polimerasi -Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C -estrarre l’RNA Sito di restrizione per * cDNA T7 o SP6 promoter digestione linearizzazione + RNA pol + NTPs + a32P-UTP Trascrizione RNA radioattivo 15

Analisi di RNA marcato su gel e autoradiografia circolare 1000V 22 mA catodo - anodo + RNA e DNA sono carichi negativamente 16

Northern blot Procedura Isolare l’RNA Elettroforesi dell’RNA su gel (agarosio o PAGE) Trasferire l’RNA su membrana (nylon) Ibridazione con una sonda marcata 17

Elettroblot (per gel di poliacrilammide) 10V 80 mA ON Membrana (nylon) gel Buffer TB 0.5X blotting paper Polo - Polo + blotting paper Membrana (nylon) gel (acrilammide) blotting paper 18

Controllo, mediante colorazione con bromuro d’etidio, del trasferimento dell’RNA 28S rRNA prima 18S rRNA dopo Membrana Gel 19

2) Rivelazione dei segnali 1) Ibridazione della membrana con una soluzione nncontenente una sonda (RNA o DNA a singolo nnfilamento) marcata radioattivamente 2) Rivelazione dei segnali Soluzione di sviluppo Soluzione di fissaggio Lastra sviluppata Lastra autoradiografica messa a contatto con il filtro A B C D Gel Lastra mRNA per la proteina X A B C D 20

espresso il trascritto? Alcune applicazioni... In quali tessuti è espresso il trascritto? 21

2. Come varia l’espressione del trascritto? stimolo + controllo di caricamento U2 snRNA miR-124a miR-98 assenza di stimolo + stimolo 22

Estratti cellulari Procedura Cellule sedimentate, incubate in tampone di lisi (contenente detergente non ionico) Dopo agitazione, gli omogenati sono centrifugati: i supernatanti contengono estratti citoplasmatici. I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati in un tampone di estrazione per ottenere gli estratti nucleari 23

Purificazione di proteine Procedura Si fissa ad un supporto solido una molecola esca che ha affinità per la proteina che vogliamo isolare (es. anticorpo) Si fa scorrere lungo il supporto solido un estratto cellulare in modo che avvenga l’interazione specifica con la molecola esca immobilizzata Si recuperano le proteine trattenute con una soluzione che ne destabilizza i legami con la molecola esca 24

Cromatografia per affinità 25

SDS-PAGE acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1% Colorazione con Blu di Coomassie acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1% 26

Analisi di interazione RNA-proteine Procedura si effettua una trascrizione in vitro dell’RNA di interesse. Si incuba il trascritto marcato con un estratto proteico contenente la proteina che si ipotizza legare l’RNA di interesse Il complesso RNA-proteina viene quindi analizzato su gel di acrilammide non denaturante 27

Analisi interazioni RNA-proteine: estratto proteico RNA radioattivo Analisi interazioni RNA-proteine: band shift incubazione RNA senza aggiunta di proteine legame specifico elettroforesi autoradiografia complesso RNA libero 28

RNA libero Saggio di band shift 29