Modelli per la regolazione della cromatina durante l’inizio della trascrizione Gli attivatori tendono a posizionarsi su regioni accessibili. Le HAT Gcn5 ed Esa1 vengono richiamate sui promotori attivi in tutto il genoma Acetilazione di H3 ed H4 mostra dei picchi sui promotori attivi. Questi eventi avvengono prima della formazione del PIC nel gene GAL1, ma può essere diverso per altri geni. Anche complessi ATP dipendenti possono essere richiamati Il richiamo dei vari fattori è di solito coordinato Molti promotori a livello genomico mostrano la presenza di PIC parziali.

PANORAMA DELLA CROMATINA DURANTE L’ALLUNGAMENTO TRASCRIZIONALE Al 5’ dell’ORF PAF è caricato sulla forma Pser5 del CTD di PolII Recluta COMPASS (Set1) per la metilazione di H3K4 Mantiene il legame di Rad6/Bre1 per la ubiquitinazione di H2B Recluta FACT per l’assemblaggio dei nucleosomi Al 3’ dell’ORF Set2 si lega alla forma Pser2 del CTD di PolII per la trimetilazione di H3K36 TFIIS e RSC contribuiscono a facilitare la trascrizione attraverso i nucleosomi.

Gradiente delle modificazioni istoniche su geni attivi: H3K4 *H3K4me2, H3K4me3, H2BUb1 sono il segnale critico per definire un dominio in trascrizione e la frequenza di passaggio della Polimerasi. * Set1 produce H3K4me1 a un livello basale indipendentemente da PAF Set1 converte H3K4me1 in H3K4me2/me3 in maniera dipendente da PAF H2BUb1 è necessaria per la di e trimetilazione. La funzione del segnale H3K4me3 è di reclutare fattori di rimodellamento: NuRD hTip60 mSIN3/HDAC yNuA3 yChd1 Tutti contengono un dominio PHD che lega la lisina trimetilata *

Gradiente delle modificazioni istoniche su geni attivi: H3K36 Set2 produce H3K36me2/me3 Segnale riconosciuto da Eaf3, subunità del complesso istone deacetilasi Rpd3S Si crea un ambiente ipoacetilato al 3’ dell’ORF

REGOLAZIONE DELLA DINAMICA NUCLEOSOMALE NELL’ALLUNGAMENTO I nucleosomi contrastano la progressione della Polimerasi II in fase di allungamento. PolII in trascrizione su nucleosomi si arresta su alcuni siti L’arresto causa un arretramento (backtracking) TFIIS con il complesso CTEA (chromatin trx enabling activity) riattiva PolII arretrata. PolII spiazza i dimeri H2A-H2B. FACT, SPT6 o Asf1 ridepositano i dimeri o depositano le forme libere presenti in forma acetilata alle spalle di PolII. Set2 metila in K4 e K36 i nucleosomi riassemblati. Eaf3 riconosce H3K36me3 e recluta Rpd3S Segue una generale deacetilazione istonica

Durante la progressione dell’allungamento trascrizionale vengono depositate o rimosse le forme alternative degli istoni, ad es. H2A.Z e H3.3 In assenza di rideposizione dei nucleosomi si scoprono promotori criptici che generano trascritti non corretti. In mutanti Spt6, FACTe Asf1 vengono generati molti trascritti criptici. Analogamente avviene per mutanti di Set2-Rpd3S LA RIDEPOSIZIONE E DEACETILAZIONE DEGLI ISTONI SONO RICHIESTE PER MANTENERE UNA CONFORMAZIONE CROMATINICA STABILE ALL’INTERNO DELL’ORF CHE E’ REPRESSIVA PER LA FORMAZIONE DI PIC SU SITI NON CORRETTI

Altri enzimi che partecipano nella fase dell’allungamento sono: Elp3 = associata con PolII nel complesso elongator, acetila H3 ed H4; non è stata ancora localizzata in vivo sulle regioni codificanti, ma i mutanti elp3 mostrano difetti di allungamento e nella crescita. Hos2 = deacetilasi di H3 ed H4; associata con le regioni codificanti; se mutata causa rallentamento delle cinetiche di attivazione genica; l’effetto contrasta con la sua attività deacetilasica; potrebbe essere importante per ristabilire un certo profilo di acetilazione permissivo per un ciclo successivo della trascrizione (forse in analogia con la funzione di Rpd3S)

ANALISI GENOMICA DELLE MODIFICAZIONI ISTONICHE ChIP-on-Chip: Isolamento di piccoli segmenti di DNA associati a una qualche forma modificata degli istoni, in combinazione con la tecnica dei micro-arrays. Lo studio più estensivo di questo tipo sulle modificazioni istoniche è stato fatto in Saccharomyces cerevisiae per quanto riguarda acetilazione, deacetilazione e metilazione delle lisine. Si può condurre l’analisi su ceppi che manchino selettivamente di uno degli enzimi modificanti preposti. Sono stati fatti esperimenti di mappatura della distribuzione di almeno 20 delle modificazioni conosciute di H3, H4, H2A, H2B e H2A.Z Alcuni dati si sono ottenuti anche con microarrays sul genoma di S. pombe e, parzialmente su D. melanogaster e uomo.

La specificità di azione degli enzimi HAT e HDAC in lievito è stata chiarita attraverso analisi genomica

Visione riassuntiva delle principali modificazioni istoniche associate con la trascrizione dei geni.

EUCROMATINA Nucleosomi che contengono Htz1 Esiste un certo grado di acetilazione anche sui promotori non attivi Sono stati identificati molti clusters di geni con un medesimo pattern di acetilazione nel promotore Sembra che questi abbiano in comune modalità di espressione simili quando esposti a condizioni di crescita analoghe

ETEROCROMATINA Nucleosomi che contengono CenH3 Nucleosomi Htz1

STRUTTURA PRIMARIA DEL CENTROMERO Lunghezza: 125bp Lunghezza: 35-110Kb Lunghezza: ~0.8-1Mb Lunghezza: ~2-4Mb Numero altamente variabile di satelliti a fiancheggiati da blocchi di satelliti a e g Dalla periferia al centro i blocchi di sequenze sono via via più omogenei.

CENP-A è una forma variante di H3 presente nel nucleosoma specializzato dei centromeri in mammifero cse4 in S. cerevisiae Cid3 in Drosophila Swi6 in S. pombe

Centromero di S.cerevisiae CBF1 e CBF3 contribuiscono a stabilire un dominio cromatinico resistente alle nucleasi Siti di sensibilità alle nucleasi Si hanno due possibilità alternative per il legame del nucleosoma a seconda che sia CBF3 o CBF1 a legarsi sulla sua superficie. Il fatto che CBF1 pieghi il DNA agevolando la formazione del nucleosoma supporta il modello (b). D’altro canto, in lievito, doppie mutazioni in cse4 e CDEI o CDEII provocano perdita di cromosomi, indicando interazione tra questi elementi e favorendo il modello (c).

HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 Drosophila: HP1 S. pombe: Swi6 Mammifero: HP1a – HP1b (MOD1 o M31) HP1g (MOD2 o M32) *amminoacidi conservati HP1a è tipica dell’eterocromatina HP1b e HP1g si possono trovare localizzati anche su siti eucromatici

Domini funzionali di HP1 CROMODOMINIO: riconosce selettivamente H3K9 metilata HINGE: è un dominio che lega DNA ed RNA senza un’evidente specificità di sequenza CHROMOSHADOW: insieme con il cromodominio forma una tasca idrofobica che funziona come dominio di legame alle proteine. Inoltre media la dimerizzazione.

HP1 è la principale proteina responsabile della formazione HP1 ha forte affinità per me3H3K9 Contemporaneamente è in grado di legare Suv39H1, la metilasi specifica per H3K9. Si pensa che si formi un nucleo iniziale dal quale si propaga lo stato eterocromatico con un meccanismo a “loop”: Istone metilato lega HP1 che a sua volta recluta metilasi Suv39H1 HP1 è la principale proteina responsabile della formazione dell’eterocromatina pericentrica HP1 interagisce anche con le DNA metiltrasferasi Dnmt1 Dnmt3a che metilano i gruppi CpG e con p150, contenuta in CAF1, chaperone per la deposizione degli istoni

Ruolo dell’RNA nella cromatina pericentrica in topo e S.pombe In topo ci sono trascritti di funzione ignota omologhi a entrambi i filamenti del satellite maggiore centromerico e trascritti “strutturali” che servono per il mantenimento della cromatina centromerica. Ruolo di RNAi ignoto. In S.pombe ci sono trascritti di orientamento inverso dalle ripetizioni esterne. I trascritti diretti sono molto poco rapppresentati. RNAi ha un ruolo chiarito: nei mutanti mancanti di Ago1 (Argonauta), Dcr1 (Dicer) o RNA-Dependent RNA Pol (RDP1) i trascritti si accumulano. Normalmente intermedi a doppio filamento vengono trasformati in siRNAs che promuovono la metilazione in H3K9, promuovendo lo stato eterocromatico

Differenze uomo-uccelli CENP-A recluta CENP-C e CENP-H in maniera indipendente CENP-B sembra essere in grado di reclutare HP1 con la conseguente formazione di eterocromatina. HP1 funziona reclutando a sua volta delle metilasi per H3K9 e K27 CENP-A è depositato in maniera non continua limitatamente alla regione delle ripetizioni di DNA satellite.

Organizzazione 3D di un centromero umano L’avvolgimento della fibra fa sì che CENP-A formi un dominio nella regione rivolta verso il polo. Nella regione opposta è presente il normale H3. Le coesine vengono reclutate dall’eterocromatina. In questa regione più centrale non è chiaro quale sia la struttura. In questa regione gli istoni sono fortemente metilati a carico di metilasi specifiche.

Replicazione della cromatina pericentrica La forca replicativa spiazza i nucleosomi. Questi vengono riformati alle sue spalle ad opera di CAF1. PCNA interagisce con CAF1. CAF1 recluta HP1. HP1 recluta enzimi per la modificazione del DNAe degli ISTONI. AcH4K5,12 viene incorporato e deacetilato subito dopo. Non si sa se H3 viene incorporato con segnali preesistenti.