Prevenzione e biocontrollo di Penicillium expansum, produttore di patulina in pomacee, mediante agenti di lotta biologica e tecniche molecolari Valentina.

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1 Prevenzione e biocontrollo di Penicillium expansum, produttore di patulina in pomacee, mediante agenti di lotta biologica e tecniche molecolari Valentina Tolaini

2 DETERIORAMENTO POMACEE IN POST-RACCOLTA FATTORI ABIOTICI  ferite  danni da raccolta  schiacciamento  umidità  temperatura FATTORI BIOTICI  batteri  funghi Penicillium expansum

3  Fungo mitosporico patogeno vive da saprofita su residui vegetali;  Penetra nel frutto attraverso ferite e lenticelle  Vettori di diffusione: vento e acqua;  Agente eziologico del MARCIUME VERDE-AZZURRO delle pomacee in post-raccolta Penicillium expansum nella polpa area infetta deliquescente, brunastra, spiccato odore di muffa sulla superficie tacche marrone-giallo ricoperte da cuscinetto di muffa biancastra che vira poi al verde- azzurro (conidi) sintomi

4 PATULINA  Fungo tossigeno produttore della PATULINA effetti tossici: immunotossicità, neurotossicità, disturbi gastro-intestinali, non esistono evidenze sulla cancerogenicità si ritrova in vari prodotti della filiera ortofrutticola (succhi, spremute, concentrati), meno in quelli fermentati perché può essere degradata dai sistemi enzimatici del lievito Saccharomyces cerevisiae processi di chiarificazione dei succhi, aggiunta di acido ascorbico, anidride solforosa, idrossido di sodio, o di adsorbenti (carbone attivo) possono abbassare significativamente il livello di contaminazione Patulina Pericolo contaminazione prodotti alimentari destinati all’infanzia

5 Tenori massimi di patulina negli alimenti: Reg. CE 466/2001 e Reg. CE 1425/2003 Normativa Codice di prassi per la prevenzione e riduzione della contaminazione da patulina: Raccomandazione della Commissione 2866/2003 Metodi di campionamento e controllo: Direttiva CE 78/2003 PRODOTTOPATULINA (μg/kg o ppb) Succhi di frutta50 Bevande spiritose, sidro e altre bevande fermentate derivate dalle mele 50 Prodotti con mele allo stato solido25 Prodotti a base di mela per l’infanzia10

6 PREVENZIONE E CONTROLLO DI PENICILLIUM EXPANSUM ATMOSFERA MODIFICATA 1-3% O 2 e 1,5-5% CO 2 TRATTAMENTI CON FUNGICIDI CHIMICI LIEVITI BASIDIOMICETI EDULI AGENTI DI BIOCONTROLLO

7 Agenti di biocontrollo LIEVITI Cryptococcus laurentii e Rhodotorula glutinis presenti nella naturale microflora di frutta e verdura (non patogeni) resistono allo stress ossidativo colonizzano tessuti di mela nelle fasi iniziali di deterioramento BIOCONTROLLO: competizione per spazio e nutrienti BASIDIOMICETI EDULI Lentinula edodes, Trametes versicolor, Auricularia auricula-judae attività antiossidante di per sé, inoltre stimolano la risposta antiossidante dell’ospite e del patogeno inibizione sintesi tossine producono sostanze ad attività antimicrobica e con proprietà farmacologiche BIOCONTROLLO: produzione β-glucani e glicoproteine

8 Obiettivi della ricerca Testare lievito (Cryptococcus laurentii) e basidiomicete (Lentinula edodes) per il controllo di Penicillium expansum produttore di patulina Sviluppare una tecnica biomolecolare di facile fruizione in campo commerciale per il rapido rilevamento del Penicillium expansum Valutare efficacia del sistema di biocontrollo a temperatura ambiente ed in condizioni di conservazione dei frutti a 4°C Approfondire le interazioni fisiologiche ospite-patogeno-agente di biocontrollo

9 Influenza di filtrati colturali liofilizzati (LF) di Lentinula edodes su germinazione conidi e crescita di Penicillium expansum No effetti su crescita patogeno  10 5 conidi di P. expansum inoculati in 2 ml di PDB con 2% p/v di LF, alternativamente, del ceppo CF23, CF24, CF42  Incubazione a 25°C per 8, 16, 20, 24, 28, 32 ore  Valutazione conidi germinati in camera di Thoma  10 5 conidi P. expansum inoculati in 50 ml PDB con 2% p/v di LF alternativamente, del ceppo CF23, CF24, CF42  incubazione a 25°C per 4, 6, 7, 8, 10, 12 e 18  Recupero micelio per filtrazione, essiccazione a 80°C per 48 h, determinazione peso secco micelio Germinazione conidi Crescita fungina LF23 inibisce germinazione conidi del patogeno fino alle 16 h, poi la rallenta significativamente LF24 LF23 100 75 ± 9 100 89 ± 7 56 ± 7 96 ± 9 50 ± 4 35 ± 2 78 ± 8 10±2 0 46 ± 5 P.expansum 32 h28 h24 h20 h16 h8 h Conidi germinati (%) 39± 5 10 ± 1 53 ± 7 0 0 27± 4 LF42 10082 ± 948 ± 67 ± 136 ± 9 0

10 Influenza di LF23 su sintesi patulina ed enzimi antiossidanti di Penicillium expansum LF23 determinano inibizione della produzione di patulina del 25% a tempi brevi LF23 stimolano CAT e GPX, mentre inibiscono SOD  10 5 conidi P. expansum inoculati in 50 ml PDB con 2% p/v di LF23  incubazione a 25°C per 7 e 17 giorni  Analisi di 20 μ l di terreno colturale in HPLC  incubazione a 25°C per 24 h, 48h, 72h, 96h e 7 giorni  recupero micelio per filtrazione e saggio attività enzimi antiossidanti (catalasi, superossidodismutasi, glutationeperossidasi) mediante analisi spettrofotometrica Analisi patulina Saggi enzimi

11 Influenza di LF23 su sintesi patulina ed enzimi antiossidanti di Penicillium expansum 7 gg 17 gg CAT GPX SOD P.expansum P.expansum+LF23

12 Influenza di LF23 su crescita ed enzimi antiossidanti di Cryptococcus laurentii (LS28) LF23 stimolano crescita lievito del 10% LF23 stimolano gli enzimi antiossidanti di LS28, aumentandone la resistenza allo stato di ossidazione e la competitività  10 5 cellule di Cryptococcus laurentii inoculate in 25 ml di NYDB con 2% p/v di LF23  incubazione in agitazione (150 rpm) a 25°C per 16, 18, 20, 22, 24, 36, 48 ore  lettura spettrofotometrica a 600 nm  recupero cellule per centrifugazione e saggio attività enzimi antiossidanti (CAT, SOD, GPX) mediante analisi spettrofotometrica Crescita Saggi enzimi

13 Influenza di filtrati colturali liofilizzati di Lentinula edodes (LF23) su crescita ed enzimi antiossidanti di Cryptococcus laurentii (LS28) Crescita Saggi enzimatici SOD citosolica CAT SOD perossisomiale GPX

14 Prove in vivo a 25°C per valutare effetto di LS28, LF23 e P. expansum su stato di ossidazione in tessuto di mela Il trattamento con LF23 e LS28 riduce la quantità di specie reattive dell’ossigeno  Mele cv Golden Delicious da agricoltura biologica  Ferite sperimentalmente e inoculate con 30 μl di sospensione di LS28 (10 6 CFU/ml), 30 μl di sospensione di LS28 (10 6 /ml) in soluzione acquosa di LF 23 al 2% p/v, 30 μl di soluzione acquosa di LF 23 al 2% p/v; dopo 2 ore con 15 μl di sospensione di P. expansum (10 4 conidi/ml)  Incubazione al buio a 25°C e 90% RH per 6 giorni (marciume evidente)  Tessuto di mela ferito recuperato e sottoposto ad analisi spettrofotometrica per anione superossido e perossidi

15 Prove in vivo a 25°C per valutare effetto di LS28, LF23 e P. expansum su stato di ossidazione in tessuto di mela CAMPIONEO 2 -. abs 470nm/mg tessuto ROOH mM Mela0,19 ±0,021,70 ±0,35 P.expansum0,33 ±0,034,35 ±0,31 P.exp+LS28+LF230,21 ±0,0182,20 ±0,32 Quantità di anione superossido e di perossidi totali in tessuto di mela dopo 6 giorni a 25°C (P<0,05) Trattamento con LS28+LF23 riduce quantità specie reattive dell’ossigeno rispetto alla mela infettata con P. expansum. Quantità comparabile a quella del controllo (mela t.q.)

16 Prove in vivo a 25°C e 4°C per valutare effetto sistema biocontrollo su marciume e sintesi patulina MATERIALI E METODI  Mele cv Golden Delicious da agricoltura biologica, ferite e inoculate  Incubazione al buio a 25°C per 6, 12, 24, 48, 72 e 136 ore o a 4°C per 10, 25, 40 gg  Misura dell’estensione del marciume e calcolo dell’attività inibitoria: AI (attività inibitoria)=[(C-T)/C]x100 dove C = diametro del marciume con patogeno T = diametro del marciume con patogeno e antagonisti  Valutazione dell’imbrunimento mediante analisi spettrofotometrica (lettura a 440 nm)  Analisi patulina in HPLC

17 P.exp+LF 23 P.exp+LS28 P.expansum P.exp+LS28+LF23 t=136 ore Prove in vivo a 25°C e 4°C per valutare effetto sistema biocontrollo su marciume CAMPIONEA.I. P.expansum0 P.expansum+LS2887±4 P.expansum+LF2325±7 P.expansum+LS28+LF23100±0 CAMPIONEAbs 440 nm/g tessuto Mela1,9 ±0,16 P.expansum4,3 ±0,31 P.expansum+LS283 ±0,25 P.expansum+LF233.7 ±0,22 P.expansum+LS28+LF232.2 ±0,19 25°C P.expansum P.expansum+ LS28+LF23 4°C 40 gg Bassa temperatura ha inibito crescita patogeno

18 Prove in vivo a 25°C e 4°C per valutare effetto sistema biocontrollo su sintesi patulina CAMPIONEINIBIZIONE (%) P.expansum0 P.expansum+LS2882 ±5 P.expansum+LF2354 ±6 P.expansum+LS28+LF2399 ±3 25°C (dopo 4°C)  Mele a 4°C: no patulina  Mele poste a 25°C (dopo 4°C) come prassi nell’industria di trasformazione: patulina prodotta in anticipo, confermata azione biocontrollo del sistema LS28+LF3 25°C 6 gg

19 Conclusioni prove fisiologiche Effetti di estratti colturali liofilizzati di L. edodes, dotati di attività antiossidante:  inibizione germinazione conidi di P. expansum a tempi brevi, poi rallentamento germinazione  stimolazione enzimi antiossidanti (CAT e GPX) del patogeno  inibizione del 25% sintesi patulina in vitro  stimolazione crescita e enzimi antiossidanti del lievito C. laurentii Individuato efficace sistema biocontrollo C. laurentii (LS28) + estratti colturali liofilizzati di L. edodes (LF23) :  inibizione in vivo, cioè su mele biologiche, di ROS, marciume e sintesi patulina

20 Individuazione di un metodo molecolare rapido ed efficace per l’early detection di P.expansum Gene target: poligalatturonasi (Genebank, AF047713) Confronto sequenza con programma BLAST (www.ncbi.nih.nlm.gov/BLAST) ed individuazione zone bassa omologiawww.ncbi.nih.nlm.gov/BLAST Disegno 2 coppie primer: Primer PG lunghezza frammento amplificato: 747 bp Primer PG1 lunghezza frammento amplificato: 135 bp Valutazione specificità primer amplificando DNA di P. expansum e di altri funghi isolati da mela Valutazione sensibilità primer PG con PCR su diluizioni di DNA fungino (0,002 pg- 2 μg) estratto da micelio e da mela ferita ed inoculata con meno di 10 conidi (dopo 6, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 ore) Valutazione sensibilità primer PG1 con PCR real time su diluizioni di DNA plasmidico contente il frammento d’interesse (0,0015 pg-150 ng)

21 Individuazione di un efficace e rapido metodo molecolare per l’early detection di P.expansum Specificità primer PG per P.expansum RISULTATI P. expansum Aspergillus ochraceus Cladosporium sp Fusarium sp Alternaria sp P.expansum+ Aspergillus ochraceus +Fusarium sp Aspergillus ochraceus +Fusarium sp No amplificazione DNA vegetale

22 Individuazione di un efficace e rapido metodo molecolare per l’early detection di P.expansum RISULTATI 2 μg 0,2 μg 20 ng 10 ng 4 ng 2 ng 4 pg 2 pg 0,2 pg 0,02 pg 0,002 pg Sensibilità primer mediante PCR classica Il limite di rilevabilità per la real time PCR è 0,0015 pg. Sensibilià primer mediante PCR real time

23 Monitoraggio crescita di P. expansum in mele incubate a 25°C mediante PCR Mele (cv Golden Delicious) ferite sperimentalmente e inoculate 15 μl di sospensione 10 4 conidi/ml (150 conidi) come precedentemente descritto Incubate a 25°C per 6, 12, 24, 48, 72, 96, 136 h Estrazione DNA Amplificazione DNA con primer PG Evidenziata differente crescita di P. expansum in funzione del tempo. Limite rilevabilità: 3,9 pg dopo 12 ore

24 Monitoraggio crescita di P. expansum in mele incubate a 25°C mediante PCR Quantità DNA fungino rilevata 3,9 ÷ 54 pg

25 Monitoraggio crescita di P. expansum in mele incubate a 25°C mediante PCR in presenza di agenti di biocontrollo Mele (cv Golden Delicious) ferite sperimentalmente e inoculate alternativamente con il patogeno, con LS28, con LF23, con LS28+LF23 Incubate a 25°C per 6, 12, 24, 48, 72, 96, 136 h Estrazione DNA Amplificazione DNA con primer PG Evidenziata differente crescita di P. expansum su mela in assenza e presenza dei vari agenti di biocontrollo. Il sistema LS28+LF23 inibisce del 100% la crescita del patogeno

26 Monitoraggio crescita di P. expansum in mele incubate a 25°C mediante PCR in presenza di agenti di biocontrollo 136h campione ng DNA fungino estratto mg micelio mg micelio/ mg mela P.expansum5,40E-023,19E-069,58E-07 P.expansum+LF234,50E-032,66E-077,98E-08 P.expansum+LS283,60E-022,13E-066,38E-07 P.expansum+LS28+LF23---

27 Monitoraggio crescita di P. expansum in mele incubate a 4°C mediante PCR in presenza di agenti di biocontrollo Mele (cv Golden Delicious) ferite sperimentalmente e inoculate alternativamente con il patogeno, con LS28, con LF23, con LS28+LF23 Incubate a 4°C per 10, 25, 40 giorni Estrazione DNA Amplificazione DNA (vegetale+fungino) con primer PG La bassa temperatura rallenta notevolmente la crescita di Penicillium expansum, ulteriormente rallentata dalla presenza del sistema di biocontrollo

28 Monitoraggio crescita di P. expansum in mele incubate a 4°C mediante PCR in presenza di agenti di biocontrollo 10 gg 25 gg 40 gg cont trat

29 Early detection di P.expansum inoculato in mela mediante Real-Time PCR Mele (cv Golden Delicious) ferite sperimentalmente e inoculate con meno di 10 conidi del patogeno Incubate a 25°C per 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 ore Estrazione DNA Amplificazione DNA con primer PG1 mediante Real-Time PCR Rilevato DNA relativo a 5-10 conidi fungini già dopo 6 ore dall’inoculo REAL TIME PCR PIU’ SENSIBILE DELLA PCR TRADIZIONALE

30 Early detection di P.expansum inoculato in mela mediante Real-Time PCR campione pg di DNA fungino/mg tessuto Mg micelio equivalenti / mg tessuto 6 ore1,3E-047,7E-12 12 ore2,6E-041,5E-11 24 ore7,8E-044,6E-11 48 ore1,1E-036,3E-11 72 ore1,7E-031,0E-10 96 ore2,6E-031,6E-10 120 ore4,5E-032,6E-10 Quantità rilevata di DNA fungino/mg tessuto 0,00013 pg-0,0045 pg

31 Early detection di P. expansum su mele commerciali mediante Real-Time PCR Estrazione DNA da mele commerciali tal quali (cv Golden Delicious) sia da agricoltura tradizionale che biologica provenienti da 4 diversi punti vendita Amplificazione DNA con primer PG1 mediante Real-Time PCR Rilevato patogeno in tutti i campioni. Real time PCR si conferma ottimo strumento di early detection di minimi inoculi del patogeno, potenziali inquinanti delle pomacee

32 Early detection di P. expansum su mele commerciali mediante Real-Time PCR Media 0,138 pg micelio/mg matrice Inoculo sufficiente a far sviluppare il patogeno dopo 10 giorni a 25°C Campione pg di DNA fungino/mg tessuto Mg micelio equivalenti/mg tessuto 1 1,06E-016,29E-09 28,79E-025,19E-09 33,15E-011,86E-08 41,22E-017,22E-09 59,88E-025,84E-09 61,66E-019,83E-09 71,16E-016,85E-09 88,70E-025,14E-09 Mele tradizionali Mele biologiche

33 Conclusioni prove molecolari Individuate ottimali condizioni di PCR per monitorare crescita patogeno in vivo e per mettere in evidenza l’azione di biocontrollo del sistema Cryptococcus laurentii + liofilizzato colturale di Lentinula edodes Individuate ottimali condizioni di Real Time PCR per early detection di Penicillium expansum su mele commerciali: tecnica più rapida e sensibile della tradizionale PCR

34 Conclusioni generali Individuato valido ed efficace sistema di biocontrollo del fungo patogeno Penicillium expansum su mela, rappresentato dal lievito Cryptococcus laurentii e dal filtrato colturale liofilizzato del basidiomicete edule Lentinula edodes. Tale sistema inibisce efficacemente sia la crescita fungina che la sintesi della patulina, grazie alla stimolazione del sistema antiossidante sia del patogeno che del lievito. Possibile utilizzo di un formulato naturale in celle di conservazione dei frutti. Messa a punto condizioni ottimali per tecniche molecolari (PCR e PCR real time) per l’early detection del patogeno. Tecniche specifiche e sensibili, consentendo di rilevare quantità minime di P. expansum che rappresentano una fonte di rischio di inquinamento delle pomacee.

35 Pubblicazioni Pcr-Based Early Detection Of Penicillium expansum In Apple (Tolaini V., Reverberi M, Punelli F, Fanelli C), poster presentato al 9th European conference on fungal genetics (ECFG), Edimburgo 5-8 Aprile 2008. Influence of a crude polysaccharidic extract from Lentinula edodes on patulin synthesis by Penicillium expansum and on the activity of two biocontrol yeasts (S. Zjalic, R. Castoria, M. Reverberi, A. Ricelli, V. Tolaini, A.A. Fabbri, C. Fanelli), poster presentato al Congresso Nazionale SIPAV, Perugia 18-20 settembre 2007. Lentinula edodes: a possible new source of compounds for the control of patulin- producing Penicillium expansum on stored apples (S. Zjalic, R. Castoria, M. Reverberi, A. Ricelli, V. Tolaini, A.A. Fabbri, C. Fanelli), poster presentato al Congresso Internazionale "Novel approaches for the control of postharvest diseases and disorders", Bologna 3-5 maggio 2007. Articoli in preparazione Monitoring of Penicillium expansum grown on apples in presence of different biocontrol agents by PCR (Tolaini V. et al.) Early detection of Penicillium expansum on apples by PCR Real Time (Tolaini V. et al.)