Dott.ssa Patrizia De Rossi “EARLY DETECTION” di ASPERGILLUS CARBONARIUS IN BACCA D’UVA e OCRATOSSINA A NEL VINO mediante APPROCCI DIAGNOSTICI INNOVATIVI.

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1 Dott.ssa Patrizia De Rossi “EARLY DETECTION” di ASPERGILLUS CARBONARIUS IN BACCA D’UVA e OCRATOSSINA A NEL VINO mediante APPROCCI DIAGNOSTICI INNOVATIVI

2 Importanza della produzione Viti-vinicola L’uva è un prodotto apprezzato dal consumatore sia: fresco (uva da tavola) essiccato (uva passita) trasformato (come succo e principalmente come vino). Europa 22 milioni q.li/anno uva da tavola 22 milioni q.li/anno uva da tavola 190 milioni hl/anno vino190 milioni hl/anno vino (74% produzione mondiale) Italia 14 milioni q.li/anno uva da tavola14 milioni q.li/anno uva da tavola 54 milioni hl/anno vino54 milioni hl/anno vino Alcuni Dati (fonte: Battilani et al, 2002) (fonte: Battilani et al, 2002) PRODUZIONE: Italia è la maggior produttrice di uva da tavola e vino in Europa CONSUMO DI VINO (annuo pro-capite): Europa 6÷64 litri (a seconda del paese) 6÷64 litri (a seconda del paese)Italia ~ 55 litri ~ 55 litri

3 5-cloro-8-idrossi-3,4-diidro-3- metilisocumarinico (anello lattonico), legato tramite un gruppo ammidico ad una L-fenilalanina. Ocratossina A (OTA) – Proprieta’ È una potente nefrotossina; è stata proposta come agente causale della Nefropatia Endemica dei Balcani Classificata nel gruppo 2B “possibile agente cancerogeno per l’uomo” dalla Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro CANCEROGENE L’Ocratossina A risulta al momento la principale micotossina segnalata nell’uva e nei suoi derivati. NEFROTOSSICHE IMMUNOTOSSICHE, GENOTOSSICHE E NEUROTOSSICHE

4 Ocratossina A (OTA)-Concentrazioni ammesse e rilevate Per es. in uva secca si sono riscontrate concentrazioni di OTA fino a 50 µ g/kg (fonte: Battilani et al, 2002) rischio Esiste un rischio di ingestione di dosi superiori alle quantità ammesse per l’OTA I tenori massimi ammissibili di Ocratossina A (Regolamento CE 1881/2006) sono: nel vino, nel mosto e nel succo d'uva, di 2 µg/Kg (ppb); nelle uve secche (uva passa, uva sultanina), di 10 µg/Kg (ppb) I tenori massimi ammissibili di Ocratossina A (Regolamento CE 1881/2006) sono: nel vino, nel mosto e nel succo d'uva, di 2 µg/Kg (ppb); nelle uve secche (uva passa, uva sultanina), di 10 µg/Kg (ppb)

5 I funghi associati all’uva in grado di produrre OTA sono risultati essere appartenenti ai generi Aspergillus e/o Penicillium(*) Aspergilli Penicilli 60%A. carbonarius 60% per A. carbonarius e 3÷5% per gli altri Aspergilli 95% Gli Aspergilli sono risultati largamente dominanti: il 95% degli isolati. Isolati positivi per l’OTA Ocratossina A (OTA) - Funghi produttori *(fonte: Battilani et al, 2002) Della sezione Circumdati: A. Ochraceus (solo occasionalmente) P. thomii, P. glabrum, P. spinulosum, P. funiculosum In particolare della sezione Nigri: A.oculeatus, A. japonicus, A. niger, A.tubingensis, A. carbonarius,

6 Lo sviluppo dei funghi Lo sviluppo dei funghi Fattori ambientali quali: temperatura, umidità, natura del substrato, danni meccanici o da insetti, stress della pianta. Aspergilli lo sviluppo è possibile in condizioni di:lo sviluppo è possibile in condizioni di: Temperatura 12÷39°C Umidità dell’aria 72÷90 % lo sviluppo è possibile in condizioni di:lo sviluppo è possibile in condizioni di: Temperatura 12÷39°C Umidità dell’aria 72÷90 % colonizzano molto precocemente l’uva, spesso prima dell’invaiaturacolonizzano molto precocemente l’uva, spesso prima dell’invaiatura la frequenza di comparsa aumenta con lo sviluppo del grappolola frequenza di comparsa aumenta con lo sviluppo del grappolo non sono in grado di perforare la buccia quindi non riescono a penetrare all’interno dell’acino se non attraverso le ferite (scoppio degli acini, colpi, punture di insetto)non sono in grado di perforare la buccia quindi non riescono a penetrare all’interno dell’acino se non attraverso le ferite (scoppio degli acini, colpi, punture di insetto)

7 La contaminazione nella filiera Viti-vinicola La contaminazione da parte di funghi micotossigeni e la produzione di micotossine nell’uva e nei derivati possono verificarsi nelle diverse fasi della filiera viti-vinicola ovvero: nel vigneto; macro-microambienti idonei; ferite, provocate da tecniche colturali e operazioni di potatura; eccessivo inverdimento, da non permette la penetrazione dei trattamenti fitosanitari Contaminazione del grappolo con il terreno; danneggiamento durante la raccolta o per eccessiva pressatura in cassetta; Trasporto in tempi non rapidi; Stoccaggio grappoli sani e intaccati da marciume mancanza di igiene (apparecchiature,ambiente); tecnica di vinificazione influenza il livello di contaminazione biologica del prodotto; modalità di conservazione Il MiPAF ha prodotto delle Linee Guida per la prevenzione della potenziale contaminazione da micotossine durante la produzione viti-vinicola (Decreto del 7 Aprile 2000) durante le fasi di raccolta, trasporto e stoccaggio delle uve dal vigneto alla cantina; in cantina durante la fase di vinificazione.

8 Scopo del lavoro Consentire un “Early Detection” Aspergillus carbonarius attraverso lo studio di marker molecolari idonei Consentire un “Early Detection” di Aspergillus carbonarius attraverso lo studio di marker molecolari idonei Elaborazione di un metodo rapido e quantitativo per l’analisi dell’Ocratossina A nel vino, attraverso il sistema di rilevamento al silicio amorfo* in modo da ottenere un sistema sensibile, semplice, veloce, che richieda l’uso di quantità modeste di solventi organici e che può essere utilizzata in “situ". *sistema messo a punto dal Dipartimento di Ingegneria elettronica-La Sapienza In modo da poter effettuare la scelta della cultivar più adatta al territorio Stabilire una eventuale correlazione tra la produzione di OTA e l’andamento della biosintesi del Resveratrolo da parte della pianta Rilevamento tempestivo di A. carbonarius direttamente da bacche d’uva Perchè?Scopo e il mio lavoro per raggiungerlo…

9 Tra i marker potenzialmente idonei all’early detection di Aspergillus carbonarius mediante amplificazione PCR, sono stati considerati i seguenti primer Tra i marker potenzialmente idonei all’early detection di Aspergillus carbonarius mediante amplificazione PCR, sono stati considerati i seguenti primer: CARCAR PksPks in banca dati si trovanoprimer disegnati sulla base di regioni ITS (Internal Transcribed spacer) comprese tra i geni codificanti gli RNA ribosomali. Queste regione, non traducendo alcun prodotto, presenta una elevata variabilità di sequenza che consente di discriminare tra le specie ed anche tra le varietà (Patino et al 2005)in banca dati si trovano primer disegnati sulla base di regioni ITS (Internal Transcribed spacer) comprese tra i geni codificanti gli RNA ribosomali. Queste regione, non traducendo alcun prodotto, presenta una elevata variabilità di sequenza che consente di discriminare tra le specie ed anche tra le varietà (Patino et al 2005) in banca dati si trovano sequenze parziali del gene codificante per polyketide synthases (PKSs) responsabili della biosintesi di OTA(Ali Atoui, et al. 2006).in banca dati si trovano sequenze parziali del gene codificante per polyketide synthases (PKSs) responsabili della biosintesi di OTA (Ali Atoui, et al. 2006). Dalle sequenze parziali sono state identificate le sequenze dei primers che consentono l’amplificazione di A. carbonarius  Selezione di marker potenzialmente idonei all’early detection Early detection di A. carbonarius: Risultati Selezione tra i marker potenzialmente idonei all’early detection di A. carbonarius marker idonei per identificare i marker idonei (ITS e pks) ad una early detection di tale fungo

10 Analisi PCR (Polymerase chain reaction)Analisi PCR (Polymerase chain reaction) Primer Pks Early detection di A. carbonarius:Risultati Early detection di A. carbonarius: Risultati specificita marker per verificare la specificita dei marker (ITS e pks) nei confronti di A. carbonarius PCR di DNA estratto da funghi isolati da uva in colture in vitro. Si è ottenuta l’amplificazione di un frammento lungo 330 pb che è risultato essere specifico esclusivamente per A. carbonarius LEGENDA: 1. A.carbonarius (manduria) 2. Acarbonarius 993 3. A. niger 1034 4. A.niger 7096 5. A.niger 4717 6. A.niger 4709 7. Alternaria sp 8. Cladosporium sp 9. A. ochraceus 10. Fusarium sp. 11. Penicillium sp. 12. controllo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 330 pb Prodotto di amplificazione diminuisce in maniera lineare al diminuire della quantità di DNA.Prodotto di amplificazione diminuisce in maniera lineare al diminuire della quantità di DNA. La quantità minima rilevabile è pari a 100 pg primer pksLa quantità minima rilevabile è pari a 100 pg primer pks

11 Fungo Fungo Fungo Early detection di A. carbonarius:Risultati Early detection di A. carbonarius: Risultati  inoculo 5±3conidi/bacca e verifica iniziale a 6h di incubazione Prove su matrice a differenti tempi di infezione per verificare la capacità del metodo all’early detection del fungo direttamente dalla matrice

12 La PCR con i primer PKS permette un rilevamento quando non è possibile un rilevamento del fungo allo stereomicroscopio (100X) Early detection di A. carbonarius:Risultati Early detection di A. carbonarius: Risultati LEGENDA: 1-3 Nero D’Avola 6h 12h, 24h; 4-6: Dama 6h 12h, 24h; 7-9:; 10-12, Merlot: 6h 12h, 24h; 330pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 24 h 330pb PCR di DNA estratto matrice inoculata.

13 Early detection di A. carbonarius:Risultati Early detection di A. carbonarius: Risultati idoneità dei primer per confermare l’ idoneità dei primer (ITS, pks,) a discriminare la presenza del fungo in campo PCR con DNA estratto da campioni di bacche d'uva tal quali utilizzando i primer selezionati

14 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 LEGENDA: cultivar: 1- Negro Amaro, 2- Refosco faetidus 3- Re Fosco vescovo 4- Dama, 5-controllo negativo, 6-acino senza inoculo. Entrambi i primers hanno determinato un prodotto di amplificazione nei campioni 1 e 4 appartenenti rispettivamente cultivar Negro Amaro e Dama; Le bacche provenienti dallo stesso grappolo dei campioni 1 e 4 hanno mostrato la presenza di A. carbonarius mentre non hanno presentato tracce di tale fungo le altre due varietà, risultate negative allo screening per PCR. Early detection di A. carbonarius:Risultati Early detection di A. carbonarius: Risultati CarPks Conferma della specificità di entrambi i primer a discriminare la presenza del fungo in campo

15 early detection per disporre di un sistema di early detection quantitativo di tale fungo Verificata l’idoneità dei primer, è stata messa a punto una early detection basata sulla Real Time PCR, la tecnica stata verificata su: DNA estratto da fungo in colture in vitroDNA estratto da fungo in colture in vitro DNA estrattobacche d'uva a differenti tempi di infezioneDNA estratto bacche d'uva a differenti tempi di infezione DNA estrattobacche d'uva tal qualeDNA estratto bacche d'uva tal quale Early detection di A. carbonarius INDAGINI MOLECOLARI con REAL TIME PCR

16 la concentrazione minima rilevabile dal sistema è per pks pari a 1 pg. L’uso della RealTime migliora la prestazione di 100 volte rispetto alla PCR. Rilevazione con SYBER-green Early detection di A. carbonarius:Risultati Early detection di A. carbonarius: Risultati  Sensibilità della RealTime PCR Curva di calibrazione PKS I risultati mostrano che il rilevamento di A. carbonarius è possibile già a 6h dall’inoculo 18 ore prima di quanto non è possibile con la PCR classica A. A. carbonarius Tempi di incubazione per A. carbonarius (ore) Ctpg/ul di DNA6381,0E+01 12352,8E+02 24282,6E+04 I primer PKS sono specifici per una early detection di A. carbonarius su bacca d’uva  inoculo 5±3conidi/bacca e verifica iniziale a 6h di incubazione

17 quantizzazione del gene pks di A. carbonarius, effettuata in Real Time PCR con i primers pks, di DNA estratti da bacca d’uva tal quale, per verificare la presenza del fungo in campo.quantizzazione del gene pks di A. carbonarius, effettuata in Real Time PCR con i primers pks, di DNA estratti da bacca d’uva tal quale, per verificare la presenza del fungo in campo. I risultati mostrano la capacità dei primer pks di discriminare la presenza del fungo in campo Cultivar DNA di A. carbonarius (pgxmg -1 di bacca d’uva) bombino nero- cesanese di anile- Dama (uva con marciume) 32,30.9 malvasia- merlot 10,80.7 montepulciano 6,30.6 Negroamaro (uva con marciume) 63,50.8 negroamaro sano 13.70.8 nero d avola 6,30.6 refosco faetidus- refosco vescovo- sangiovese- campioni con la più alta concentrazione di DNA di fungo avevano, al momento della raccolta, evidenti segni di marciume ad una ispezione visiva I campioni risultati positivi allo screening della Real Time, pur non mostrando evidenti segni di marciume, al momento della raccolta, hanno sviluppato il micelio fungino quando le bacche, provenienti dallo stesso grappolo dei campioni, erano poste ad incubare per 7 giorni a 30˚C. Early detection di A. carbonarius:Risultati Early detection di A. carbonarius: Risultati  Prove in Real Time su campioni di bacche d'uva tal quali

18 Conclusioni La PCR classica e la PCR Real Time messe a punto in questo lavoro permettono di individuare la presenza del fungo quando altri metodi ispettivi non lo permettono!La PCR classica e la PCR Real Time messe a punto in questo lavoro permettono di individuare la presenza del fungo quando altri metodi ispettivi non lo permettono!

19 Correlazione OTA-Resveratrolo: Articolazione delle fasi di ricerca Sui campioni di bacca d’uva a tempi differenti di infezione da A. carbonarius: OTA Resveratrolo Per stabilire una eventuale correlazione tra la produzione di OTA da parte del fungo e la biosintesi del Resveratrolo da parte della pianta Bacche d’uva Analisi della produzione di Resveratrolo da parte della bacca d’uvaAnalisi della produzione di Resveratrolo da parte della bacca d’uva Analisi della produzione di Ocratossina A da parte del fungoAnalisi della produzione di Ocratossina A da parte del fungo

20 quantitativi di Ocratossina A prodotti A. carbonarius dopo l’ inoculo con il 5±3conidi/bacca nelle tre differenti cultivar e incubato a 30°C per 6h, 12h, 24h, 48h e 120h.quantitativi di Ocratossina A prodotti A. carbonarius dopo l’ inoculo con il 5±3conidi/bacca nelle tre differenti cultivar e incubato a 30°C per 6h, 12h, 24h, 48h e 120h. Correlazione OTA-Resveratrolo:Risultati Correlazione OTA-Resveratrolo: Risultati

21 Variazione della concentrazione di Resveratrolo, dovuta alla presenza del fungo tossigeno, nei campioni di uva appartenenti alle tre differenti cultivar inoculati con il minimo inoculo, 53conidi/bacca.Variazione della concentrazione di Resveratrolo, dovuta alla presenza del fungo tossigeno, nei campioni di uva appartenenti alle tre differenti cultivar inoculati con il minimo inoculo, 53conidi/bacca. Correlazione OTA-Resveratrolo:Risultati Correlazione OTA-Resveratrolo: Risultati

22 I risultati mostrano che utilizzando la Real Time PCR è possibile individuare la presenza del fungo già a 6h dall'inoculo, cioè circa 18h prima di quanto sia individuabile con la PCR classica. LEGENDA:, d=Dama, mt=Merlot na=Nero D' Avola I valori sono il risultato di tre repliche in tre esperimenti indipendenti. REAL TIME PCRREAL TIME PCR La crescita del fungo ha un andamento esponenziale in funzione del tempo. Nel caso della cultivar Nero D’Avola, il più basso coefficiente dell’esponenziale sta a indicare una crescita più lenta che nelle altre due cultivar. Early detection di A. carbonarius:Risultati Early detection di A. carbonarius: Risultati Primer PKS 6h 6h 6h

23 Correlazione OTA-Resveratrolo:Risultati Correlazione OTA-Resveratrolo: Risultati un incremento nella produzione di Resveratrolo, nelle prime 40h può svolgere un controllo significativo nella sintesi di OTA (Nero D’Avola); un incremento nella produzione di Resveratrolo dopo le 40 ore di incubazione può avere il solo effetto di ritardare l’accumulo di OTA (Merlot), La minore velocità di crescita del fungo nella cultivar Nero D’Avola farebbe ipotizzare che un aumento del resveratrolo nelle prime ore di incubazione rallenta la crescita del fungo

24 Conclusioni La Real time PCR messa a punto costituisce così un metodo rapido che riduce i tempi necessari per verificare l’influenza di un parametro ambientale o l’efficacia di un trattamento sullo sviluppo di A.carbonariusLa Real time PCR messa a punto costituisce così un metodo rapido che riduce i tempi necessari per verificare l’influenza di un parametro ambientale o l’efficacia di un trattamento sullo sviluppo di A.carbonarius Il Resveratrolo sembra essere capace di controllare nel tempo la produzione di OTA in determinate cultivar (Nero d’Avola)Il Resveratrolo sembra essere capace di controllare nel tempo la produzione di OTA in determinate cultivar (Nero d’Avola)

25 Sistema di rilevamento che usa un sensore al silicio amorfo per quantificare il la micotossina*. Misura OTA nel Vino Rosso: Una metodica innovativa Struttura a strati di silicio n-i-p, depositati sul substrato genera una fotocorrente da un segnale luminoso Substrato di vetro su cui è stato depositato un Ossido Trasparente Conduttivo Sensore Substrato Sorgente Radiazione UV monocromatica Campione Ocratossina A λ em =442nm λ ex = 310 nm *sistema messo a punto dal Dipartimento di Ingegneria elettronica-La Sapienza OTA solution L’obiettivo è di sfruttare la fluorescenza naturale della Ocratossina A Radiazione luminosa corrente elettrica

26 vino rosso Le misure sono state fatte utilizzando standard di ocratossina A e campioni di vino rosso contaminato con diverse concentrazioni di OTA: Misura OTA nel Vino Rosso: Risultati solventi: esano,esano, etile acetato,etile acetato, esano:etile acetato 10:90esano:etile acetato 10:90 esano:etile acetato 90:10esano:etile acetato 90:10 previa estrazione: Vino rosso contaminato con OTA+ solvente Estratto di OTA Composti del vino Estratto di OTA portato a secco aria piastra a debole calore Cloroformio (CHCl3),Cloroformio (CHCl3), Cloruro di metilene (CH2Cl2)Cloruro di metilene (CH2Cl2) cloroformio e metanolo 2:1.cloroformio e metanolo 2:1. 98% efficienza estrattiva

27 Misura OTA nel Vino Rosso: Dal Prototipo che misurava su estratti di vino rosso dopo corsa cromatografica Ritaglio lastrina HPTLC Supporto Sensore Corsa cromatografica Misura sensore

28 Dispositivo che interfacciato al pc misuri in Real Time la corsa cromatografica fornendo il valore della concentrazione della Ocratossina A Camera cromatografica Smart glass Vaschetta per eluente comunica via cavo USB con il pc Scheda acquisizione dati Misura OTA nel Vino Rosso: Sistema integrato

29 Il sensore fornisce una fotocorrente DIRETTAMENTE PROPORZIONALE alla quantità di OTA presente (limite di rilevamento di 1 ng negli estratti di vino e 1ng negli standard) Misura OTA nel Vino Rosso: Risultati Standard OTA OTA estratti di vino rosso

30 Conclusioni Il “dispositivo Integrato” messo a punto è un sistema portatile per il rilevamento rapido dell’Ocratossina A nel vino rosso.Il “dispositivo Integrato” messo a punto è un sistema portatile per il rilevamento rapido dell’Ocratossina A nel vino rosso.