Coltura Cellulare ●Insieme di cellule mantenute “in vitro”, derivanti dalla disgregazione di tessuti o isolate da fluidi biologici come il sangue. ●Le.

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1 Coltura Cellulare ●Insieme di cellule mantenute “in vitro”, derivanti dalla disgregazione di tessuti o isolate da fluidi biologici come il sangue. ●Le cellule vengono poste a contatto di tutti i fattori e metaboliti necessari alla loro crescita.

2 Coltura Cellulare

3 Laboratorio di Coltura Cellulare
Spazio o area di lavoro Abbigliamento da laboratorio Reagenti colturali Vetreria e Plastica di laboratorio Cappa a flusso laminare

4 CAPPA A FLUSSO LAMINARE
Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,5 m/sec. I filetti di aria sterile trascinano lontano dall’area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici. Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air): prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la superficie filtrante; l’efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%. Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni non la protezione dell’operatore e dell’ambiente

5 Cappa a flusso laminare di classe II

6 Condizioni fisico-chimiche
● pH ● Sistema tampone (NaHCO3) ● Temperatura 35-37°C

7 Condizioni fisico-chimiche
● In alcuni casi si può incorporare nel mezzo di crescita un colorante sensibile al pH per avere un controllo visivo dello stato del pH durante la crescita. rosso-arancio a ph 7.3 rosso-viola a ph alcalino giallo-arancio a ph acido Rosso Fenolo

8 ●La pressione parziale (pCO2) di CO2 (5%) usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO2 cellulare misurata all’interno dei tessuti (35-45 mmHg, equivalgono al % di CO2). Così l’incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule

9 Tipi di Coltura di Cellule “in vitro”
Coltura Primaria Linea cellulare continua

10 Coltura Primaria ●Coltura preparata direttamente da un tessuto: le cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro dopo le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita) Vantaggi : le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le attività biochimiche delle cellule in vivo Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a lungo termine

11 Ciclo vitale di Cellule Primarie

12 Linea Cellulare Continua
●Isolamento di ceppi clonali: il programma genetico della senescenza è stato annullato attraverso mutazioni spontanee o indotte ● Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di colture primarie non tumorali Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose Vantaggi: cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati meno variabili delle colture primarie Svantaggi: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellulare

13

14 Coltura Primaria Coltura a breve termine Coltura a lungo termine
< 10 duplicazioni duplicazioni

15 Linea Cellulare Continua
> duplicazioni

16 Le prime Linee Cellulari Continue
1952, Johns Hopkins University 1963, University of Ibadan HELA RAJI

17 Mezzo di Coltura ●I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule ●I più comuni terreni base di coltura: -MEM: Minimum Essential Medium -DMEM: Dulbecco’s modification of MEM -RPMI: Roswell Park Memorial Institute Differiscono per la concentrazione in amminoacidi, sali e concentrazione di glucosio

18 Mezzo di Coltura Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di essere utilizzato, viene complementato con: Glutammina (aa essenziale molto labile) Antibiotici (penicillina/streptomicina) Siero (supplemento più comune delle colture cellulari)

19 Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS)
Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, elementi minerali Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS)

20 SIERO

21 Sistemi di Crescita ADESIONE: cellule di origine nervosa, epiteliale o mesenchimale (che in vivo fanno parte di tessuti solidi) Fenomeno che richiede l’interazione di recettori di membrana con proteine adesive, adsorbite sulla superficie della piastra di coltura SOSPENSIONE: cellule di origine ematopoietica (che normalmente vivono in un mezzo fluido)

22 Distacco delle cellule in adesione
Soluzione di EDTA e tripsina -EDTA: chela il Ca2+ e il Mg 2+, indispensabili per l’adesione -Tripsina: enzima proteolitico, derivato da pancreas porcino. Degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti al substrato

23 Protocollo di tripsinizzazione
●Lavare le cellule (2X) con PBS (phosphate buffered saline) ●Aggiungere un volume adeguato di tripsina (pre-riscaldata) ●Incubare a 37°C per almeno 3 min ●Neutralizzare la tripsina con mezzo completo di FBS

24 Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidità
Protocollo di tripsinizzazione ●Trasferire la sospensione in una provetta e centrifugare 5 min per giri al min ●Aspirare il sovranatante ●Aggiungere il terreno fresco e separare le cellule ●Distribuire nelle nuove piastre Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidità in modo da tenere le cellule fuori dall’incubatore il minor tempo possibile

25 Efficienza di semina Tempo di duplicazione
-Generalmente le cellule, al di sotto di una certa densità non crescono in modo efficiente -Regola generale: densità > 104 cellule/cm2 Tempo di duplicazione -La popolazione cellulare cresce in modo esponenziale: il numero di cellule raddoppia ad ogni duplicazione -Il tempo impiegato per ogni duplicazione è caratteristico di ogni linea cellulare: circa ore per le cellule animali e ore per le cellule umane

26 Plastica per coltura Sono generalmente in polistirene:
-materiale rigido con superficie lucida -buona resistenza chimica a soluzioni acquose -limitata resistenza a solventi -totale assenza di tossicità per le cellule in coltura -trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio -la superficie è trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero)

27 Piastre

28 Tipi di Piastre Diametro (mm) Superficie (cm2) Volume (ml) 35 8 1-2 60
21 4-5 100 55 10-12 150 148 20-30

29 Multi-well

30 Tipi di Multi-well Multi-well Superficie (cm2) Volume (ml) 96 0,32
0,1-0,2 48 1,0 0,3-0,6 24 1,88 0,5-1,2 12 3,83 1,0-2,4 6 9,40 2.0-3,0

31 Fiasche

32 Tipi di Fiasche Fiasche Superficie (cm2) Volume (ml) T-25 25 5-10 T-75
15-25 T-150 150 30-50 T-175 175 35-60 T-225 225 45-70

33 Morfologia Colturale Cellule aderenti Cellule semi-aderenti
Cellule in sospensione

34 Linee Cellulari Aderenti Epiteliali
Hela

35 Linee Cellulari Aderenti Endoteliali
CPAE

36 Linee Cellulari Aderenti Fibroblastoidi
COS-1

37 Linee Cellulari Aderenti Neuronali
NEURO 2-A

38 Linee Cellulari Continue Semi-Aderenti

39 Linee Cellulari Continue in Sospensione
a singole cellule a piccoli clumps a grandi clumps

40 A Singole Cellule BV-173

41 A Singole Cellule K-562

42 A Singole Cellule NB-4

43 MIDOLLO ADULTO Cellula Staminale Ematopoietica (HSCs)
Cellula Staminale Mesenchimale o Stromale (MSCs)

44 IL MIDOLLO OSSEO

45 Ematopoiesi Il Sistema Ematopoietico rappresenta un continuum di cellule che progressivamente manifestano differenti caratteristiche biologiche: … da cellula staminale a … vari tipi cellulari differenziati Variazioni biologiche rilevate nei vari compartimenti “maturanti” non riflettono quelle che si attuano nel compartimento staminale I vari compartimenti ematopoietici sono controllati da differenti fattori che variano indipendentemente l’uno dall’altro

46 Ininterrotta formazione di elementi giovani
Ematopoiesi Ininterrotta formazione di elementi giovani del sangue a partire da cellule staminali: origine a tutte le linee emopoietiche

47 HSC Differentation Citochine
Il processo è regolato da un intricato numero di fattori di crescita e citochine Citochine Prodotte attraverso meccanismi autocrini e paracrini da cellule non ematopoietiche quali stromali ed endoteliali

48 Citochine -L’interleuchina 3 (IL-3) ed il granulocyte/macrophage colony stimulating factor (GM-CSF): inducono la proliferazione cellulare dei progenitori iniziali

49 Citochine -L’eritropoietina, l’interleuchina 5 (IL-5) ed il macrophage colony stimulating factor (M-CSF): agiscono essenzialmente sulla proliferazione e\o differenziazione dei progenitori più avanzati e sull’attivazione delle cellule terminali mature. -Flt-3 ligand e kit ligand proteggono le cellule dall’apoptosi

50 Chemochine Inibizione della crescita dei progenitori
Regolazione della migrazione dei progenitori ematopoietici Mediare lo sviluppo delle cellule T nel timo SDF-1 (che lega il recettore CXCR4) media il processo di homing di HSCs e progenitori nel midollo dopo il trapianto

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52 HSCs Assay

53 Short-term in vitro Assays
I prototipi dei saggi funzionali a breve termine sono rappresentati dai saggi a colonie La sospensione cellulare viene quindi piastrata in terreno semisolido rappresentato da metilcellulosa oppure da agar.

54 Composizione Grandezza Colore
la progenie che deriva da una singola cellula costituisce una colonia che differisce dalle altre per: Composizione Grandezza Colore Ogni colonia rappresenta un continuum di progenitori “lineage committed”

55 Nell’ambito di un data linea cellulare, i progenitori con differenti livelli di maturità, possono essere riconosciuti in base a tre diversi parametri: Sensibilità di risposta ai fattori di crescita Tempo necessario per generare una progenie di cellule differenziate La grandezza e la particolare morfologia delle colonie

56 ●Cellule progenitrici della serie eritroide (BFU-E e CFU-E) progenitori iniziali e più differenziati rispettivamente ●Cellule progenitrici della serie granulo-macrofagica (CFU-GM, CFU-G e CFU-M) ●Cellule progenitrici della serie megacariocitaria (BFU-MK, CFU-MK)

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58 Limite dei Saggi a Colonie a Breve Termine
Non risultano adeguati per identificare progenitori più immaturi Inadeguatezza dei mezzi semisolidi utilizzati L’efficacia di un mezzo semisolido non supera le tre settimane

59 Una Stem Cell molto immatura necessita di un periodo superiore a settimane affinchè possa garantire una progenie di cellule differenziate.

60 Long-Term Culture Presenza di un feeder layer costituito da cellule che da un lato fungono da substrato e dall’altro provvedono a secernere fattori di crescita nel tentativo di ricostituire il microambiente ematopoietico

61 Concetto di Nicchia Microambiente stabile per la cellula staminale
E’costituita da cellule e componente extracellulare che può ospitare una o più cellule staminali e controllarne l’autorinnovamento nonchè la produzione di progenie La matrice extracellulare insieme alle molecole di adesione definiscono i confini spaziali della nicchia e modulano l’espressione di molecole di adesione nonchè quelle deputate al signalling

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63 Immunofenotipo delle h-HSCs
CD34: HSCs e precursori ematopoietici CD133: HSCs e precursori ematopoietici CD45, CD43, CD38, CD59, CD90, Flt3,….

64 Applicazioni cliniche
Trapianto HSCs: Leucemie, Hodgkin disease, Non-Hodgkin lymphoma -limitata disponibilità del donatore -compatibiltà del donatore -numero sufficiente di HSCs necessità di migliorare l’espansione ex-vivo

65 Applicazioni cliniche
Patologie non maligne: - Malattie autoimmuni (SCID, scleroderma, SLE, artrite reumatoide) Anemia falciforme, Beta Talassemia Combinazione tra trapianto e Terapia Genica: tecnica ancora in fase di sperimentazione

66 FONTI DI MSCs Midollo osseo Tessuto adiposo Sangue cordonale placenta
Sangue periferico

67 MSCs

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69 Nicchia delle MSCs. Mesenchymal stem cells (MSCs) are shown in their putative perivascular niche (BV, blood vessel), interacting with (1) various other differentiated cells (DC1, DC2, etc.) by means of cell-adhesion molecules, such as cadherins, (2) extracellular matrix (ECM) deposited by the niche cells mediated by integrin receptors, and (3) signaling molecules, which may include autocrine, paracrine, and endocrine factors. Another variable is O2 tension, with hypoxia associated with MSCs in the bone marrow niche.

70 Procedura di isolamento di cellule staminali
da midollo osseo ●Diluizione del midollo osseo 1:5 in Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) + 2% fetal bovine serum (FBS) e frazionamento secondo un gradiente di densità (Ficoll-Hypaque) per 30 minuti a 240 x g. ●Raccolta dello strato di cellule mononucleate compreso tra lo strato acquoso e il Ficoll. Lavaggio (2X) in PBS e 2% FBS a 160 x g. ●Il pellet è risospeso in 5-10 ml in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), supplementato con il 20% FBS, 1% l-glutammina, senza aggiunta di antibiotici ed antimicotici. ●Conta cellulare e semina ad un volume di 1 x 107 cells/cm2 in 6 well dishes. ●Le cellule saranno cresciute a 37°C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2.

71 Procedura di isolamento di cellule staminali
da midollo osseo ●Cambio di mezzo di coltura approssimativamente dopo una settimana dalla semina delle cellule; le hMSC aderiranno alla plastica di coltura cellulare entro i primi 5-7 giorni. ● Le cellule saranno poi espanse mediante l’allontanamento delle cellule non aderenti nel corso dei cambi di mezzo di coltura. Sarà possibile centrifugare il mezzo allontanato e ripiastrarlo in un nuovo disco di coltura. ● E’ importante mantenere le cellule ad una giusta confluenza per impedire che possano differenziare. Le colture confluenti saranno staccate dalla piastra mediante il trattamento tripsina-EDTA. ● Le cellule saranno congelate in una soluzione di congelamento costituita da 10% DMSO e 90% siero.

72 Dopo circa 5-7 settimane si ottiene una popolazione omogenea di cellule aderenti, con aspetto simil-fibroblastico, la quale continua a proliferare senza differenziare spontaneamente fino a 40 generazioni.

73 La differenziazione adipocitaria viene indotta con un terreno contenente desametasone (1 mM), insulina e 3-isobutil-1-metilxantina, fattori che attivano le vie metaboliche della sintesi lipidica.

74 La differenziazione osteoblastica viene indotta con un terreno contenente desametasone in quantità minori rispetto a quello usato nella differenziazione adipocitaria (0.1 mM), acido ascorbico e β-glicerofosfato. Le cellule assumono una forma poligonale e depositano nello spazio extra-cellulare una matrice mineralizzata rifrangente la luce al microscopio ottico, che si colora intensamente mediante colorazioni tipo von Kossa o reazioni alla fosfatasi alcalina.

75 La differenziazione condrocitaria viene ottenuta con un terreno simile a quello osteogenico, contenente desametasone ed acido ascorbico, ma con l’aggiunta di Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1), prolina ed altri fattori. Le cellule assumono una morfologia globosa e si dispongono in filiere similepiteliali. La matrice cartilaginea viene colorata intensamente mediante blu di toluidina e le cellule diventano positive, in immunoistochimica, per il collagene di tipo II.

76 La differenziazione miogenica viene indotta incubando le cellule con amphotericina B o con 5-fluorocitidina: si osserva un progressivo allungamento delle cellule, la formazione di miotubuli e la comparsa di attività contrattile spontanea o indotta da acetilcolina. L’avvenuta differenziazione miocellulare viene dimostrata in immunoistochimica attraverso l’espressione di miogenina, myo D (fattore di trascrizione coinvolto nella differenziazione delle cellule mesenchimali in senso mioblastico).

77 DIFFERENZIAMENTO OSTEOGENICO
Colorazione istochimica fosfatasi alcalina

78 DIFFERENZIAMENTO CONDROGENICO
Colorazione immunoistochimica con Ab anti-collagene II

79 DIFFERENZIAMENTO ADIPOGENICO
Colorazione istochimica Red Oil

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