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ELETTROFORESI
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Gli acidi nucleici migrano sempre verso il polo positivo per la presenza nella loro molecola di cariche negative dei gruppi fosfato (PO 4 3- ). Molecole, come gli aminoacidi, i peptidi, le proteine, i nucleotidi e gli acidi nucleici, possiedono gruppi ionizzabili e quindi, ad ogni valore di pH, sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche
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Soluzione tampone: perché? In caso di acidi o basi organiche la loro dissociazione dipende dal valore di pH. Se ci troviamo in un anfolita (composti che hanno sia proprietà acide che basiche, es: Aminoacidi) sia la loro direzione che la loro velocità sono dipendenti dal pH. Per diminuire le variazioni di pH si usa un tampone. Una soluzione tampone consiste in una soluzione elettrolita composta da un acido e la sua base coniugata. Questa ha una duplice funzione nel processo, condurre corrente elettrica e, come scritto sopra, mantenere costante il pH.
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Elettroforesi come controllo l’elettroforesi può essere utilizzata per studiare diversi campioni di sostanze quali proteine, siero, sangue; e per individuare anomalie nell’organismo, non solo animale ma anche umano. Questa infatti è utilizzata durante le analisi del sangue e può mostrare anomalie tra le quali tumori, disfunzioni ormonali, malfunzionamento renale o epatico.
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Supporti La tecnica dell’Elettroforesi può avvenire su vari supporti. Quelli maggiormente utilizzati sono: 1- Carta (elettroforesi delle globuline del sangue) 2- Fase liquida (all’interno di capillari) 3- Su gel
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Elettroforesi su gel 1) Il gel non contiene cariche in quanto non sono presenti gruppi ionizzanti 2) è possibile avere gel con maglie di grandezza variabile (in base alla concentrazione della matrice da usare), per tale motivo si effettua una separazione non solo in base alla carica ma anche in base al peso molecolare. 3) si possono facilmente recuperare i campioni dopo la separazione elettroforetica.
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I gel maggiormente utilizzati nei laboratori di biologia molecolare sono costituiti da : - poliacrilamide, (PAGE) - agarosio. Le due sostanze danno origine ad una gelatina Il gel viene preparato in opportuni tamponi : -TBE (Tris Borato EDTA) -TAE (Tris Acetato) Usualmente per la separazione di molecole : - a più basso peso molecolare si usa come supporto del gel l'acrilamide - a più alto peso molecolare si usa come supporto l'agarosio
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Un po’ di chimica… GEL D’AGAROSIO L'agarosio è un polimero lineare naturale di galattosio e 3,6 anidro-galattosio GEL D’ACRILAMIDE (PAGE) Il gel è formato dalla polimerizzazione di acrilamide.
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In entrambi i supporti Acrilamide o Agarosio, si assembla il sistema su un apparecchio per elettroforesi o CELLA ELETTROFORETICA. Esistono in commercio un gran numero e modelli di celle elettroforetiche, di varia : - forma - grandezza - verticali - orizzontali.
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I gel possono essere polimerizzati in tubicini di vetro in modo da ottenere cilindretti di acrilamide di piccolissimo spessore (elettroforesi capillare) su cui si può stratificare un singolo campione. Comunemente si usano i cosiddetti gel piatti ottenuti per polimerizzazione del gel tra due lastre di vetro, che consentono il caricamento di più campioni.
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Vaschette orizzontali I sistemi orizzontali offrono il vantaggio di poter in ogni istante analizzare la corsa elettroforetica in quanto non contemplano l'assemblaggio delle lastre di vetro alla vaschetta. E' quindi possibile anche ad intervalli ravvicinati rimuovere il gel(solitamente di agarosio perché più resistente alle varie manipolazioni) ed analizzare la migrazione delle bande. Tutte le celle elettroforetiche sono costituite da 2 vaschette contenenti il tampone (TAE o TBE) ed in comunicazione tra loro alle quali sono collegati il polo negativo e positivo tra cui si genera una d. d. p.
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Come avviene… Il sistema è collegato ad un alimentatore in grado di creare il campo elettrico. Grazie al campo elettrico generatosi la miscela di frammenti comincerà a migrare verso il polo positivo in base al loro diverso peso molecolare: quelle più pesanti (a maggior PM) migreranno più lentamente rispetto a quelle più leggere (a minor PM), che a loro volta migreranno più velocemente.
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VERTICALE ORIZZONTALE
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Cosa si ottiene… Il risultato della corsa elettroforetica consisterà in una serie di bande. Sul gel si depone anche una miscela di frammenti a PM noto (MARKER) che servirà per il calcolo della lunghezza in basi delle bande incognite
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Come si evidenzia… E' possibile visualizzare la corsa elettroforetica grazie a coloranti inerti: -BPB (Blu di bromofenolo) -XC ( Xilene cianolo ) che si muovono nel campo elettrico come molecole a PM noto, Terminata la corsa è possibile evidenziare il pattern elettroforetico mediante una colorazione specifica dovuta alla presenza di ETIDIO BROMURO (EtBr),un agente intercalante che si frappone tra le basi azotate ed è evidenziabile alla luce UV, colorando le bande di DNA di arancione. E' possibile quindi calcolare il PM e quindi la grandezza in paia di basi dei frammenti misurando la distanza in cm percorsa da ciascun frammento (mobilità elettroforetica) a partire dal pozzetto fino al termine della corsa.
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Un po’ di matematica… Dopo la corsa si costruisce una retta di taratura su un grafico semilogaritmico utilizzando le bande del MARKER, una miscela di frammenti a PM noto, riportando in ascisse la migrazione in cm ed in ordinata il logaritmo del peso molecolare (espresso come paia di basi). Interpolando sulla retta di taratura la migrazione dei frammenti incogniti si può risalire alla grandezza di ogni frammento. Infatti la mobilità elettroforetica è inversamente proporzionale al log del peso molecolare.
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