Sistemi adoperati per l'espressione dei geni di interesse

Presentazione sul tema: "Sistemi adoperati per l'espressione dei geni di interesse"— Transcript della presentazione:

1 Sistemi adoperati per l'espressione dei geni di interesse
E’ virtualmente possibile esprimere geni in sistemi di ogni tipo utilizzando vettori di espressione appropriati, in funzione di esigenze specifiche I più diffusi: Escherichia coli Bacillus subtilis Cellule di lievito Cellule di insetto/sistemi virali Cellule vegetali Cellule di mammifero in coltura

2 La sequenza segnale di 24 aa è rimossa quando la proteina raggiunge il RER, con conseguente formazione della proinsulina. Nel Golgi sono poi rimossi aa (connecting sequence) e si instaurano i legami S-S tra le catene A e B (forma attiva dell’insulina).

3 Insulina era ottenuta dal pancreas bovino o porcino
(usati dal 1922) (3-5 kg di tessuto pancreatico per paziente per anno) Insulina bovina differisce dall’insulina umana per 3 aminoacidi Insulina porcina differisce dall’insulina umana per 1 aminoacido Tali differenze determinano una risposta allergica L’insulina umana è preferita ed è più sicura

4 La prima insulina umana ricombinante
Il gene codificante la proinsulina è stato clonato in un opportuno plasmide ed espresso in E.coli L’espressione in E.coli porta alla formazione di corpi di inclusione ricchi di insulina Isolamento di insulina dai corpi di inclusione è un procedimento lungo e costoso

5 1978: sintesi dei geni codificanti le catene A e B e clonaggio in 2 vettori di espressione.
Aggiunta di una sequenza codificante un peptide leader di 24 aa all’estremità 5’. I due costrutti sono adoperati per trasformare cellule di E.coli. Purificazione delle catene A e B e formazione dei ponti disolfurici in provetta.

6 Escherichia coli Ampiamente studiato Facilità di crescita
Vantaggi economici ed “etici” Le strategie elaborate potrebbero essere applicabili, in linea di principio, a tutti i sistemi

7 Espressione genica Caratteristiche biologico-molecolari che influenzano la produzione di proteine ricombinanti: Natura delle sequenze promotrici e di arresto della trascrizione Forza del sito di legame per il ribosoma Numero di copie del gene clonato Localizzazione cellulare della proteina estranea Efficienza della traduzione nell’organismo ospite Stabilità intrinseca della proteina estranea nella cellula ospite Non esiste un’unica strategia che assicuri la massima espressione di ogni gene clonato. La maggior parte dei geni clonati possiede proprietà molecolari peculiari, le quali impongono di investire tempo e lavoro considerevoli prima di riuscire a trovare un insieme di condizioni specifico, atto a garantire livelli di espressione accettabili.

8 Vettori di espressione procariotici
CARATTERISTICHE GENERALI Un vettore per l’espressione eterologa deve contenere i seguenti elementi: Origine di replicazione Marker di selezione Promotore Terminatori di trascrizione Codoni di terminazione della traduzione Multiple cloning sites Elementi genetici specifici per determinate applicazioni: Sequenze segnale per secrezione Sequenze geniche codificanti partners di fusione Sequenze geniche codificanti peptidi utili per l’isolamento

9 Si utilizzano promotori forti e regolabili
Ottimizzazione dell'espressione Un livello di espressione elevato e costante del gene clonato spesso risulta nocivo per la cellula ospite Drenaggio di energia Funzioni essenziali per la cellula ospite sono compromesse Perdita del plasmide Si utilizzano promotori forti e regolabili

10 Promotori regolabili: il promotore lac
Se nel mezzo di coltura manca il lattosio, il promotore lac di E.coli è represso, cioè spento, dalla proteina repressore lac, la quale impedisce la trascrizione dell’operone lac L’induzione o l’accensione del promotore lac si ottiene aggiungendo al mezzo lattosio o un suo analogo (isopropil-β-D-tiogalattopiranoside, IPTG) Entrambe le sostanze impediscono che il repressore lac si leghi all’operatore lac, consentendo perciò la trascrizione

11 La trascrizione dell’operone lac è regolata anche dal legame della proteina
di attivazione da catabolita (CAP) alla regione del promotore Legandosi al promotore, la CAP ne accresce l’affinità per l’enzima RNA polimerasi, determinando un incremento della trascrizione dei geni a valle del promotore L’interazione della proteina CAP con il cAMP determina un incremento della sua affinità per il promotore → l’elevata concentrazione intracellulare di cAMP (segnale di carenza energetica) può determinare elevati livelli di trascrizione dei geni a valle del promotore lac Nei vettori di espressione plasmidici è generalmente presente il promotore lacUV5, variante del promotore lac, che contiene una sequenza nucleotidica alterata nella regione -10 ed è più forte del promotore lac presente in natura

12 Il promotore trp è regolato negativamente dal complesso triptofano-proteina
repressore di trp, che si lega all’operatore trp ed impedisce che l’operone trp sia trascritto. L’attivazione del promotore trp si ottiene o allontanando il triptofano o aggiungendo al mezzo di coltura acido 3-indolacrilico. Il promotore tac è stato realizzato in vitro e comprende la regione -10 (cioè 10 coppie di nucleotidi a monte del sito di inizio della trascrizione) del promotore lac e la regione -35 del promotore trp. Anche il promotore tac è represso dal repressore lac ed attivato dall’aggiunta di lattosio o di IPTG.

13 Il promotore tac

14 Il promotore pL è un promotore del batteriofago λ
E’ controllato dalla proteina repressore cI del batteriofago λ Per regolare la trascrizione diretta da pL si utilizza generalmente un mutante termosensibile del repressore cI, denominato cI857 Le cellule in possesso del repressore termosensibile sono fatte crescere ad una temperatura di °C, temperatura alla quale il repressore cI impedisce la trascrizione diretta dal promotore pL Quando la coltura cellulare ha raggiunto lo stadio di crescita desiderato (fase log intermedia), si innalza la temperatura a 42°C, ciò che inattiva il repressore termosensibile cI e consente che la trascrizione abbia luogo

15 X Il promotore pL cI857 Se si innalza la temperatura
Gene di interesse Se si innalza la temperatura il repressore cI857 (termolabile) si inattiva → attivazione della trascrizione

16 Il promotore del batteriofago T7 è riconosciuto dalla RNA polimerasi del fago
Per servirsi di questo promotore si inserisce il gene della RNA polimerasi T7 nel cromosoma batterico, sotto il controllo del promotre tac La trascrizione diretta da entrambi i promotori (T7 e tac) è indotta dall’aggiunta di IPTG In tali condizioni la polimerasi è prodotta ed il gene clonato è trascritto e tradotto Tra il momento in cui è indotta la trascrizione del gene della polimerasi T7 e quello in cui è trascritto il gene bersaglio si verifica spesso un ritardo di circa un’ora Per trarre vantaggio dalla forza del promotore T7 è stata messa a punto una serie di plasmidi detti vettori pET Gli elevati livelli di espressione di questo sistema a cascata hanno spesso reso necessaria l’introduzione nella cellula ospite di un altro plasmide, detto pLysS, contenente il gene del lisozima del fago T7, che è in grado, legandosi alla RNA polimerasi T7, di inattivarla

17 L’RNA polimerasi del fago T7 è così attiva e selettiva che il prodotto proteico
desiderato può costituire più del 50% delle proteine cellulari totali dopo poche ore di induzione I livelli di espressione possono essere ridotti diminuendo la concentrazione di induttore La riduzione dei livelli di espressione può incrementare la resa di proteina di interesse in forma solubile

18 Il legame della proteina di attivazione da catabolita (CAP) alla regione del
promotore dipende dai livelli cellulari di cAMP I livelli di cAMP sono fortemente influenzati dalla fonte di carbonio presente nel mezzo di crescita In presenza di glucosio i livelli di cAMP sono bassi ed il livello di trascrizione sarà basso, dal momento che si osserverà una riduzione dell’affinità della proteina CAP per il promotore Quando il glucosio è assente e la cellula è forzata ad utilizzare una fonte di carbonio alternativa, ad es. glicerolo, i livelli di cAMP aumentano e la conseguente formazione del complesso CAP/cAMP attiva la trascrizione a partire dal promotore lac Dunque l’induzione completa dell’operone lac è raggiunta solo in presenza sia dell’induttore sia di elevati livelli di cAMP

19 L’induttore IPTG lega il repressore, riducendo la sua affinità per l’operatore
lac, con conseguente attivazione della trascrizione Quando i livelli di cAMP sono sufficientemente elevati, ad es. in assenza di glucosio, il complesso CAP/cAMP che si forma lega immediatamente la regione a monte del promotore, attivando ulteriormente la trascrizione In presenza di glucosio, il complesso CAP/cAMP non si forma e la trascrizione è ridotta (repressione da catabolita)

20 Il sistema pET

21 Controlli trascrizionali del sistema pET
Il profago λDE3 codificante la RNA polimerasi T7 è posto sotto il controllo del promotore L8-UV5, che ha 3 mutazioni puntiformi che lo distinguono dal promotore lac wild type Due mutazioni puntiformi nella regione -10 determinano un aumento di forza del promotore ed una riduzione della sua dipendenza dalla stimolazione CAP/cAMP La terza mutazione è localizzata nel sito di legame al complesso CAP/cAMP e determina una riduzione dell’affinità per tale complesso → tale mutazione riduce, ma non elimina la sensibilità alla repressione da catabolita L’effetto delle 3 mutazioni è la creazione di un promotore più forte, ma meno sensibile all’effetto del glucosio, ciò che consente una forte induzione dell’espressione della RNA polimerasi da parte dell’IPTG in presenza di glucosio

22 Sebbene i promotori lac e L8-UV5 siano repressi in assenza di induttore,
entrambi mostrano una certa attività basale Nel caso dei lisogeni λDE3, l’espressione di una piccola quota di RNA polimerasi T7 può provocare problemi se il gene clonato nel vettore pET codifica una proteina tossica per la cellula ospite → per tale motivo ulteriori meccanismi di controllo sono costruiti nei vettori pET e negli organismi ospiti I vettori con un promotore “T7lac” hanno un promotore T7 seguito da una sequenza operatore lac In questi vettori il repressore si lega all’operatore, riducendo la trascrizione da parte di eventuali molecole di RNA polimerasi T7 che possono essere espresse in assenza di induttore Un altro meccanismo di controllo è fornito dall’utilizzo di ospiti batterici contenenti il plasmide pLysS, che esprime il lisozima T7, una proteina che lega ed inibisce la RNA polimerasi T7 La necessità di adoperare tali meccanismi di regolazione aggiuntivi dipende dal tipo di proteina ricombinante che si desidera esprimere → le proteine più tossiche per le cellule batteriche sono quelle che richiedono meccanismi di regolazione aggiuntivi

23 Sebbene il promotore L8-UV5 sia meno sensibile all’attivazione da parte del
complesso CAP/cAMP rispetto al promotore wild type, è stata riscontrata una riduzione significativa della trascrizione basale in presenza di glucosio Tale fenomeno risulta importante soprattutto quando gli ospiti batterici, trasformati con un vettore di espressione pET e non dotati del plasmide pLysS, sono fatti crescere fino a raggiungere la fase stazionaria E’ stato infatti osservato che durante la fase stazionaria l’espressione basale è massima L’aggiunta di glucosio alla concentrazione finale di % al mezzo di coltura LB previene l’incremento della trascrizione basale osservato in colture batteriche che raggiungono la fase stazionaria Uno svantaggio dell’utilizzo del glucosio risiede nel fatto che, dopo una fase iniziale di crescita rapida, i prodotti del catabolismo del glucosio determineranno una diminuzione del pH del mezzo di coltura, con conseguente riduzione della densità cellulare nella fase stazionaria E’ stato osservato che una forte induzione della trascrizione del gene della RNA polimerasi T7 può essere ottenuta in presenza di glucosio Bisogna comunque ricordare che i livelli più elevati di induzione sono attesi quando il glucosio è assente ed i livelli di cAMP sono elevati

24 Le condizioni ottimali (inibizione stringente della trascrizione basale ed alti
livelli di espressione indotta) possono essere raggiunte facendo crescere le cellule batteriche in presenza di glucosio per poi utilizzare un mezzo di coltura privo di glucosio al momento dell’induzione I ceppi batterici lisogeni per λDE3, trasformati con i vettori pET, possono essere fatti crescere in una varietà di mezzi di coltura se le proteine ricombinanti espresse non sono tossiche E’ preferibile adoperare sia un vettore pET dotato di un promotore T7lac sia ospiti batterici dotati del plasmide pLysS nel caso in cui le proteine ricombinanti siano potenzialmente tossiche per la cellula batterica ospite In generale è preferibile che un ceppo lisogeno per λDE3, trasformato con un plasmide pET contenente il gene di interesse, non raggiunga la fase stazionaria In caso contrario è preferibile aggiungere glucosio % al mezzo di coltura, in modo da ridurre la trascrizione basale

25 Una strategia alternativa, adatta all’espressione di geni i cui prodotti sono
molto tossici per la cellula ospite, consiste nell’introduzione della RNA polimerasi T7 mediante infezione con il batteriofago CE6 CE6 è un fago λ ricombinante contenente il gene della RNA polimerasi sotto il controllo del promotore pL e del repressore termosensibile cI857 Quando il fago CE6 infetta un determinato ospite, l’RNA polimerasi di nuova sintesi trascrive il DNA bersaglio in maniera così attiva che il normale sviluppo del fago non può procedere Sebbene tale metodo sia meno conveniente dell’induzione del lisogeno DE3, è preferibile in quei casi in cui il prodotto proteico ricombinante è troppo tossico per essere mantenuto in altro modo Nessuna molecola di RNA polimerasi T7 è presente nella cellula prima dell’infezione, ciò che consente di esprimere in questo modo un qualunque DNA bersaglio clonato sotto il controllo di un promotore T7

26 Produzione di Proteine Ricombinanti
pET-22b(+)

27 Controllo dei promotori regolabili
Il gene della proteina repressore ed il promotore corrispondente possono essere collocati in due plasmidi distinti, i quali mantengano nella cellula un numero di copie diverso Una simile disposizione mantiene la proporzione appropriata tra proteina repressore e promotore Di solito il gene repressore è collocato su un plasmide a basso numero di copie (da 1 a 8 copie per cellula), mentre la sequenza del promotore si inserisce in un plasmide ad elevato numero di copie (da 30 a copie per cellula) Alternativamente il gene della proteina repressore può essere trasportato come singolo gene nel DNA cromosomiale, disposizione che mantiene bassi i livelli della proteina repressore Nei sistemi che fanno uso del promotore lac, una forma variante del gene lacI (lacIq) produce livelli molto maggiori del repressore lac, facendo perciò diminuire la trascrizione del gene clonato in assenza di induttore

28 Esempio: come aumentare la produzione di proteine
Plasmidi/cellula Plasmide 28ºC 42ºC Promotore pL pKN402 82 521 NO pPLc2833 38 42 SI pCP3 60 713 Repressore cI termosensibile integrato nella cellula ospite Inserendo il gene della DNA ligasi T4 nel plasmide pCP3, circa il 20% delle proteine cellulari prodotte a 42ºC risulta costituito da DNA ligasi T4

29 Serie di geni in tandem unidirezionali
In generale il livello dell’espressione genica è proporzionale al numero di copie del gene trascritto nella cellula ospite → aumentando il numero di copie del plasmide si verificherà l’aumento concomitante della proteina sintetizzata dal gene clonato Oltre al gene clonato, però, il plasmide contiene altri geni trascritti L’incremento del numero di copie determina una deviazione delle risorse della cellula verso la produzione delle proteine codificate dal plasmide, comprimendo le attività metaboliche della stessa cellula ospite La strategia alternativa consiste nel clonare più copie del gene in esame in un plasmide a basso numero di copie, anziché clonarne una sola copia in un plasmide ad elevato numero di copie Il problema tecnico è quello di creare serie in tandem di un gene con le sequenze sempre orientate nel modo giusto per essere trascritte e tradotte

30 al suo sito di riconoscimento sul DNA
Per risolvere il problema si può ricorrere all’enzima di restrizione AvaI ed al suo sito di riconoscimento sul DNA In seguito al taglio, il trattamento con la DNA polimerasi I consente di riempire le estremità coesive Un sito di riconoscimento per EcoRI è poi saldato alle estremità nette Il gene, munito di segnali di inizio e di arresto, è clonato in un sito EcoRI Il gene è poi separato dal plasmide digerendo con AvaI In questo modo l’inserto di DNA non avrà estremità coesive identiche Durante la reazione catalizzata dalla DNA ligasi i segmenti potranno congiungersi secondo un unico orientamento AvaI

31 In alternativa è possibile utilizzare adattatori direzionali sintetici = brevi
sequenze di oligodeossiribonucleotidi aggiunte alle estremità del DNA di un plasmide linearizzato ed al frammento di DNA contenente il gene Durante la reazione di ligasi i segmenti di DNA saranno orientati in un solo verso Tale strategia non risulta limitata dal requisito che dal gene bersaglio siano assenti i siti AvaI ed EcoRI Nella pratica l’espressione dei geni dell’interferone si accentua realmente in proporzione al numero di copie di geni in tandem, almeno fino a quattro copie del gene per ogni plasmide Le copie dei geni in tandem risultano talvolta instabili a livello del DNA e, nel corso della crescita, alcune di esse, o anche tutte, possono essere eliminate dal plasmide

32 Elevata efficienza di traduzione
Nell’mRNA dei procarioti è presente un sito di inizio della traduzione definito sito di attacco del ribosoma (sequenza di Shine-Dalgarno) Si tratta di una sequenza di 6-8 nucleotidi (ad esempio UAAGGAGG), posta nell’mRNA, in grado di appaiarsi con una sequenza complementare situata nella componente RNA della subunità ribosomiale minore Quanto più forte è il legame dell’mRNA con l’RNA ribosomiale tanto maggiore è l’efficienza dell’inizio della traduzione Sono stati progettati numerosi vettori di espressione in E.coli atti ad assicurare che l’mRNA del gene clonato contenga un sito di attacco forte per il ribosoma

33 Per ciascun gene clonato è importante stabilire che il sito di legame del
ribosoma sia ubicato adeguatamente e che la struttura secondaria dell’mRNA non ne impedisca l’accesso al ribosoma Sono stati elaborati numerosi vettori che incorporano sia i segnali trascrizionali sia i segnali traduzionali per l’espressione eterologa di geni eucariotici in E.coli pKK233-2 Marcatore selezionabile Ampr Il promotore tac Il sito di attacco del ribosoma di lacZ Un codone di inizio ATG collocato 8 nucleotidi a valle I codoni di arresto (terminatori) della trascrizione T1 e T2 del batteriofago λ

34 Si inserisce il gene clonato in un sito NcoI,
PstI o HindIII posto tra il sito di legame del ribosoma ed i codoni di arresto della trascrizione Se il gene clonato non si trova nella stessa cornice di lettura del codone di inizio ATG si possono effettuare piccoli adattamenti per correggere la cornice di lettura Al termine dell’induzione e della trascrizione, l’mRNA del gene clonato è tradotto in maniera efficiente Le sequenze nucleotidiche che codificano gli aminoacidi nella regione N-terminale della proteina bersaglio variano da un gene all’altro e non è dunque possibile progettare un vettore che sopprima in tutti i casi la possibilità che l’mRNA si ripieghi su se stesso I vettori di espressione descritti sono punti di partenza per ottimizzare l’inizio della traduzione

35 Proteine chimeriche (GST)
L’enzima glutatione-tio-transferasi (GST) da Schistosoma japonicum è una proteina altamente solubile E’ stato dimostrato che la fusione di una proteina ricombinante all’enzima GST determina un incremento della solubilità del prodotto chimerico durante la fase di iperespressione La presenza della GST inoltre facilita la purificazione delle proteine ricombinanti grazie all’utilizzo di cromatografie che sfruttano l’elevata affinità della GST per il glutatione ridotto (GSH) Tra la GST e la proteina ricombinante è generalmente interposto un sito di riconoscimento per una proteasi specifica, ciò che consente la separazione della proteina di interesse dalla GST nel corso della procedura di purificazione

36 Le proteine di fusione sono caratterizzate dalla presenza della GST
all’estremità N-terminale mentre la proteina ricombinante di interesse è localizzata all’estremità C-terminale In seguito all’induzione dell’espressione, la proteina chimerica si accumula nel citoplasma della cellula batterica ospite La GST è una proteina di Da che può essere espressa n E.coli nella sua forma enzimaticamente attiva La GST conserva la sua attività enzimatica nei costrutti chimerici e può andare incontro a dimerizzazioni simili a quelle osservate in natura

37 Mappa dei 10 vettori pGEX contenenti la sequenza codificante la GST

38 Glutatione S-transferasi come partner di fusione
Le GSTs costituiscono una classe di enzimi che utilizzano il glutatione ridotto come substrato per inattivare piccole molecole tossiche. GST Proteina (220 aa) Sito di taglio per proteasi Glutatione Proteina GST resina Data l’elevata affinità della GST per il suo substrato, le proteine chimeriche contenenti la GST possono essere isolate mediante cromatografia di affinità. La fase stazionaria è costituita da una matrice di agarosio su cui è immobilizzato il glutatione ridotto. L’eluizione delle proteine contenenti la GST è eseguita in presenza di un eccesso di glutatione ridotto in forma libera. Eluizione con un eccesso di GSH

39 RIMUOVO IL SOVRANATANTE CONTENENTE LE PROTEINE NON LEGATE
ESTRATTO PROTEICO GLUTATIONE IMMOBILIZZATO RIMUOVO IL SOVRANATANTE CONTENENTE LE PROTEINE NON LEGATE CENTRIFUGAZIONE + LAVAGGI CON TAMPONE FOSFATO

40 di taglio della trombina
Produzione di un polipeptide fibrillogenico ricombinante 220 100 60 45 30 20 8 12 36 kDa 10 kDa SDS-PAGE WESTERN BLOT L-V-P-R-G S GST [1-93]ApoA-I L-V-P-R G S Sito di taglio della trombina

41 Proteine chimeriche (MBP)
La Maltose-Binding Protein (MBP) è una proteina periplasmatica codificata dal gene mal E di E.coli Si tratta di un componente del sistema batterico di trasporto del maltosio Come nel caso della GST, è stato dimostrato che la fusione di una proteina ricombinante alla MBP determina un incremento della solubilità del prodotto chimerico durante la fase di iperespressione La MBP presenta il vantaggio di essere codificata dal gene mal E di E.coli → i codoni e la struttura secondaria dell’mRNA dovrebbero essere idonei a garantire un’espressione efficiente nell’ospite batterico Il confronto tra GST e MBP, per quanto riguarda gli effetti sulla solubilità del partner di fusione, non è mai stato effettuato a parità di condizioni, quali ceppo ospite, tipo di vettore, lunghezza del dominio di connessione tra i due componenti del costrutto chimerico

42 Vettori di espressione contenenti la sequenza codificante MBP
I vettori contengono il promotore tac La sequenza codificante il sito di riconoscimento per il fattore Xa è adiacente al primo sito di restrizione del polylinker Il vettore pMAL-p2 contiene il peptide segnale della MBP → la proteina di fusione è esportata nello spazio periplasmico VANTAGGI: Isolamento della proteina di fusione mediante shock osmotico Ridotta esposizione a proteasi Favorita la formazione dei ponti disolfurici della proteina di interesse Non tutte le proteine di fusione sono trasportate in maniera efficiente nel periplasma

43 Proteina di fusione MBP pMAL Proteina di interesse
Promotore tac gene malE MBP pMAL Proteina di interesse cDNA di interesse In questo caso la cromatografia sfrutta l’elevata affinità della MBP per il maltosio. Tra la MBP e la proteina ricombinante è generalmente interposto un sito di riconoscimento per una proteasi specifica. Resina Maltosio legato Eluizione Isolamento della proteina di fusione

44 Sito di taglio per proteasi
N C Proteina di fusione Tag Proteina Sito di taglio per proteasi

45 Proteine chimeriche (tag di istidine)
Un tratto di istidine ripetute è in grado di legare con elevata affinità un certo numero di metalli di transizione E’ stato dimostrato che una proteina che presenta un tratto esposto di 6 residui di istidina (His)6 è in grado di legare con elevata affinità una resina caricata con ioni divalenti di metalli di transizione (nickel o cobalto) Il tratto (His)6 deve essere localizzato in una regione esposta e relativamente flessibile della proteina, generalmente all’estremità N- o C- terminale Può risultare utile la presenza di uno o due residui di Gly tra la sequenza (His)6 ed il resto della proteina → siti unici di riconoscimento per proteasi possono essere inseriti e consentire la rimozione del tratto (His)6 al termine della procedura di purificazione

46 Il clonaggio può essere effettuato in maniera tale che il tratto (His)6 risulti
localizzato all’estremità N- o C-terminale della proteina ricombinante di interesse.

47 Le proteine dotate del tag (His)6 possono essere convenientemente
purificate mediane cromatografia di affinità su metalli chelati o immobilizzati (IMAC: Immobilized Metal Affinity Chromatography) Si adopera una resina a cui sono legati ioni divalenti di metalli di transizione grazie alla presenza di gruppi funzionali chelanti Il ligando chelante può essere acido iminodiacetico (IDA) oppure acido nitrilotriacetico (NTA) Lo ione metallico è legato alla resina lasciando liberi alcuni (in genere due) siti di coordinazione del metallo, in modo che esso possa stabilire legami con la proteina dotata di (His)6 L’anello imidazolico della catena laterale dell’istidina è in grado di stabilire legami di coordinazione con ioni divalenti di metalli pesanti, quali Ni2+, Zn2+, Cu2+ e Co2+ La cromatografia può anche essere effettuata in condizioni denaturanti, in presenza di detergenti o di agenti denaturanti, senza che venga alterata la capacità di legame

48 Proteina con tratto (His)6
legata alla resina Fase stazionaria E’ mostrato un nuovo chelante tetradentato che crea con gli ioni dei metalli di transizione un legame molto forte. Ciò evita il distacco del metallo dal gel di affinità ed aumenta la capacità di legame di questo per le proteine marcate con il tag (His)6.

49

50 Proteine chimeriche (tioredossina)
La tioredossina di E.coli (trxA) è una proteina implicata in numerose funzioni cellulari, quali la riduzione dei ponti disolfurici ed il metabolismo del solfato TrxA è anche un cofattore della DNA polimerasi del fago T7 ed è coinvolta nell’assemblaggio del fago T7 e di altri fagi filamentosi La proteina è stata espressa in maniera stabile e ad elevati livelli in diverse condizioni sperimentali Si tratta di una proteina citoplasmatica estremamente solubile E’ stata adoperata come partner di fusione di diverse citochine e fattori di crescita di mammifero → trxA era localizzata all’estremità N- terminale dei costrutti chimerici Le proteine fuse alla trxA risultavano estremamente solubili nel citoplasma di E.coli in diverse condizioni sperimentali Oltre ad essere solubile, trxA ha dimensioni ridotte (109 aa; Da), una stabilità termica intrinseca ed è localizzata sul lato citoplasmatico delle zone di adesione tra la membrana cellulare interna ed esterna

51

52 La sequenza codificante trxA è localizzata a
monte delle sequenze codoficanti His·tag ed S·tag. Siti di riconoscimento unici per proteasi consentono la rimozione di trxA e di His·tag (trombina) o dei tre tags (enterochinasi). Flexible linker peptide

53 Proteine con ponti disolfurici
Molte proteine necessitano di formare ponti disolfurici stabili per assumere la propria conformazione nativa → in assenza di ponti disolfurici, tali proteine possono essere degradate o possono accumularsi nei corpi di inclusione Il ceppo di E.coli AD494 presenta una mutazione del gene codificante la tioredossina reduttasi (trxB), l’enzima che normalmente catalizza la riduzione della tioredossina (trxA) Ciò consente la formazione di ponti disolfurici nel citoplasma di E.coli Tale ceppo si è rivelato particolarmente utile per l’espressione di proteine ricombinanti solubili, contenenti ponti disolfurici In alcuni casi si sono ottenuti ottimi risultati adoperando ceppi di E.coli che presentavano anche una mutazione del gene gor codificante l’enzima glutatione reduttasi

54 I ponti disolfurici che si formano nel citoplasma sono rapidamente ridotti grazie
all’azione di enzimi riducenti, quali gli enzimi tioredossina reduttasi e glutatione reduttasi. L’inattivazione di componenti di tale pathway dovrebbe consentire la formazione di ponti disolfurici, rendendo il citoplasma un ambiente più ossidante. Concettualmente l’inattivazione di entrambi i pathways (trxB e gor) dovrebbe rendere il citoplasma di E.coli ancora più ossidante. Un ceppo doppio mutante è stato isolato ed è risultato in grado di crescere in condizioni di aerobiosi (ceppo FA113 o OrigamiTM). Sono disponibili anche i ceppi Origami(DE3) e Origami(DE3)pLysS.

55 Gli enzimi della famiglia Dsb catalizzano la formazione di ponti
disolfurici nello spazio periplasmico dei batteri gram-negativi e sono dunque necessari per il corretto ripiegamento di numerose proteine secrete.

56 Proteine chimeriche (peptide S)
La proteasi subtilisina catalizza la scissione di un singolo legame peptidico della RNasiA, determinando la formazione della RNasi S, composta da due frammenti strettamente associati → il peptide S (residui della RNasi A) e la proteina S (residui ) Sebbene i singoli frammenti non siano dotati di attività enzimatica, la RNasi S ha un’attività enzimatica simile a quella della RNasi A intatta L’elevata affinità del peptide S per la proteina S può facilitare l’isolamenti di proteine ricombinanti fuse al peptide S

57

58 Gene codificante la β-galattosidasi
Sito di riconoscimento per fattore Xa Gene codificante la β-galattosidasi

59 Proteine chimeriche (CBD)
I domini di legame alla cellulosa (CBDs: Cellulose Binding Domains) costituiscono regioni discrete delle cellulasi CBDs rappresentano una nuova classe di tags che possono essere fusi all’estremità N- o C-terminale della proteina ricombinante di interesse E’ possibile isolare le proteine di fusione eseguendo una cromatografia che sfrutta l’elevata affinità dei CBDs per la cellulosa Si tratta di una procedura di purificazione economica che ha il vantaggio di consentire l’eluizione della proteina ricombinante di interesse in condizioni non denaturanti

60

61

62

63

64 Proteine chimeriche (NusA)

65 NusA è una proteina di E.coli molto solubile, espressa ad elevati livelli
NusA è stata fusa all’estremità N-terminale di numerose proteine normalmente presenti nei corpi di inclusione La fusione di tali proteine a NusA ha determinato un incremento della solubilità del prodotto chimerico

66 AAG CTT ATG GTC GGC Inserto da clonare
HindIII AAG CTT ATG GTC GGC Inserto da clonare GTT GCG CAA GCT TCG Vettore recipiente GTT GCG CAA GCT TAT GGT CGG C Non è in frame! CGA TGG CAA GCT TAT ATG GTC GGC