Elettroforesi Un processo mediante il quale molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilità m = K c/ M = mobilità.

Presentazione sul tema: "Elettroforesi Un processo mediante il quale molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilità m = K c/ M = mobilità."— Transcript della presentazione:

1 Elettroforesi Un processo mediante il quale molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilità m = K c/ M = mobilità elettroforetica della molecola K =costante di proporzionalità che dipende dalla ddp applicata e dal mezzo in cui viene fatta l’elettroforesi M = PM della molecola

2 Elettroforesi di aa Gli aa si frazioneranno durante l’elettroforesi, se l’elettroforesi viene effettuata ad un valore di pH al quale gli aa presenti nella miscela , avranno differenti valori di carica netta Se l’elettroforesi viene fatta ad un pH che corrisponde al PI dell’aa esso non migra

3 Elettroforesi di proteine
PI è compreso tra 3-10, la maggioranza ha pI <8 Quindi a PH = 8 o a pH > 8 la maggior parte delle proteine hanno carica netta – e migreranno all’anodo ( elettrodo positivo)

4 Supporto per l’elettroforesi
Gel di poliacrilammide : copolimerizzazione di un monomero (acrilammide) solubile in acqua e di un agente reticolante Bisacrilammide ( CH2=CH-CO-NH2) acrilammide

5 Preparazione del gel di poliacrilammide
I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda, x cui si forma un polimero lineare. Occasionalmente i monomeri di acrilammide si legano alla bis acrilammide e si firmano legami crociati

6 Agenti polimerizzanti
Ammonio persolfato e TEMED ( tetrametilenetilendimina) APS eTEMED catalizzano la decomposizione dello ione persolfato con la formazione del sorrispondente radicale libero S2O e SO42-+ SO42-

7 Reazione tra Acrilammide e Radicale libero
R. + A RA. RA. + A RAA. RAA. + A RAAA. E così via Catalisi radicalica R. = radicale dello ione persolfato A= monomero di acrilammide

8 Come possono essere regolate le dimensioni dei pori ?
Variando la quantità di acrilammide usato Aumentando la quantità di Bis ( pori più stretti) Proteine più grandi sono ritardate nella migrazione Le più piccole migrano di più

9 Gel in gradiente Gel in cui la percentuale di acrilammide varia dal basso verso l’alto, così varia la porosità. Per separare proteine con PM molto vicino

10 SDS -PAGE Separare le proteine solo in base al loro PM
SDS : ( ogni 2 aa si lega una molecola di SDS

11

12

13 Stacking gel E’ costituito da una piccola percentuale di acrilammide per assicurare un’alta porosità E’ tamponato con Tris HCl a pH 6,8 Lower gel Percentuale di acrilammide è più alta Tris HCL pH 8,8

14 Tampone di corsa Tris a pH 8,3 con Glicina
Il campione + tampone contenente colorante( blu di bromofenolo), SDS e beta mercaptoetanolo viene caricato sullo stacking gel dopo bollitura

15 TECNICHE ELETTROFORETICHE

16 SDS-PAGE

17 RELAZIONE MOBILITA’ ELETTROFORETICA / MASSA PROTEINA

18 Elettroforesi in condizioni native
Consente di separare la proteina in base alla sua attività biologica Non denatura la proteina Gel di poliacrilammide 7,5% senza SDS pH: 8.7 Separazione in base alla carica e setaccio molecolare del gel

19 Procedura Corsa elettroforetica
Identificazione dell’Enzima di interesse: 1-Incubazione del gel in una soluzione contenente S in grado si fornire un P colorato in corrispondenza dell’E 2-Inclusione di S in un gel di agarosio che viene fatto polimerizzare sul gel si acrilammide Diffusione di E ed S tra i due gel produce bande colorate dove è presente E

20 IEF separazione in base al differente PI delle proteine
Gel orizzontali montati su piastre si vetro o foglietti di plastica separazione su un gel in gradiente di pH Anfoline ( miscele di acisi poliammino-policarbossilici sintetici) Gel di poliacrilammide a basse concentrazioni(4%) o agarosio DDP alte 2500Volt x 2-3 ore la corsa è fatta su piastre refrigerate

21 Colorazione Gel viene lavato in TCA 10%, che fa precipitare e fissare le proteine ed lava gli anfoliti Colorazione in comassie decoloraione

22 Elettroforesi bidimensionale
IEF in tubicini di vetro, in presenza di anfoliti urea 8M ed un detergente non ionico- Proteine denaturate si separano in base al loro PI il gel è estruso dai tubi e incubato in SDS in modo che il detergente si leghi alle proteine denaturate Gel posto su SDS-PAGE

23 Western Blotting Identificazione di una proteina di interesse in una miscela proteica totale Estrazione ed isolamento della proteina

24 Procedura SDS-PAGE Trasferimento su nitrocellulosa
Incubazione con anticorpi specifici immunorivelazione

25 Trasferimento su nitrocellulosa
Preparazione di un sandwich che contiene gel e nitrocellulosa Sandwich immerso in un tampone di trasferimento in una camera con elettrodi La corrente perpendicolare al gel trasferisce le proteine dal gel alla nitrocellulosa

26 Dopo il trasferimento Incubazione del blot con gelatina o latte o BSA
Incubazione con anticorpi primari Lavaggi Incubazione con anticorpi secondari marcati in vario modo

27 Anticorpi secondari legati ad un E
E legato all’anticorpo secondario è immerso in una soluzione contenente il S che si trasforma in un P colorato che precipita sulla proteina riconosciuta E : la fosfatasi alcalina o la perossidasi di rafano

28 Perossidasi alcalina BCIP (incolore) Prodotto blue
5-bromo-4-cloro-indolofosfato Perossidasi di rafano 4-cloro-1-naftolo P blue 3-ammino-9-etilcarbazolo P marrone

29 Enhanced chemiluminescence
Perossidasi in presenza di H2O2 e luminolo, ossida il luminolo e produce luce, che viene rivelata su lastra fotografica Luminolo + H2O luminolo ossidato+ fotone perossidasi

30 Anticorpi secondari con isotopo radioattivi
125I Rivelazione per autoradiografia

31 Anticorpi secondari con fluoresceina
Rivelazione: esponendo il blot alla luce UV Anticorpi secondari marcati con particelle d’oro Si colorano in rosso a contatto con Anticorpo primario

32 Gel di agarosio agarosio: polisaccaride lineare, formato dalla ripetizione di monomeri di agarobiosio e di galattosio e 3,6 anidro galattosio

33 Gel di agorosio Separazione di DNA o frammenti di acido nucleico in base alle loro dimensioni Perché si usa l’agarosio? DNA e i frammenti analizzati sono + grandi delle proteine Agarosio forma un gel a pori di dimensioni maggiori della poliacrilammide

34 Gel di agarosio Separa frammenti da 100 basi a 20kb
Nel campione da separare si aggiunge etidio di bromuro , colorante che si intercala tra le basi ed è altamente fluorescente all’UV

35 Preparazione del gel di agarosio
Agarosio 0,3% x separare DNA a doppio filamento di dimensioni tra 5-60kb Agarosio al 2% x separare DNA a doppio filamento di dimensioni tra tra 0,1-3kb Agarosio allo 0,8% x separare molecole tra 0,5 e 10kb

36 Procedura Agarosio è sciolto per bollitura in apposito tampone
Versato su lastra di vetro o plastica circondato da nastro adesivo o da una vaschetta di plastica in modo che lo spessore sia di 3mm Pettine x pozzetti immerso nell’agarosio ancora liquido Pettine tolto quando l’agarosio è solidificato Gel immerso nella cameretta elettroforetica ricoperto di tampone Campioni sciolti in tampone (saccarosio e gliceroloe blu di bromofenolo) caricati nei pozzetti Corsa elettroforetica ON 1,5V/cm

37 Colorazione Gel immerso in una soluzione di etidio bromuro (0,5mg/ml), che si lega tra le coppie basi di DNA Dove ci sono frammenti di DNA il bromuro di etidio si concentra All’UV il bromuro di etidio rende fluorescente il DNA, producendo una luce rosso-arancio

38 L’elettroforesi su gel di agarosio
L’elettroforesi su gel è una tecnica utilizzata per separare frammenti di DNA in funzione delle loro diverse dimensioni.

39

40

41 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Estrazione e purificazione del DNA Elettroforesi su gel di agarosio con bromuro di etidio Osservazione del gel ai raggi UV

42 Recupero del DNA dal gel: uso preparativo del gel di agarosio
Bande vengono tagliate dal gel, e recuperate x elettroeluizione Bande sminuzzate e in tampone e centrifugate, nel surnatante si recupera il DNA

43 Elettroeluizione Bande poste in tubo da dialisi con tampone
Tubo posto in una camera orizzontale con una maggiore quantità di tampone tra i due elettrodi Passaggio corrente stacca il DNA dal gel rRecupero del DNA nel tampone del tubo da dialisi

44 Isolameto dei frammenti di DNA x elettroeluzione
Dopo elettroforesi la banda corrispondente al frammento che ci interessa viene rimosa dal gel Banda messa in un sacchetto da dialisi e immersa in una soluzione ad alto sale Recupero della banda

45 Southern Blotting Identificazione di un pezzo di DNA che vogliamo riconoscere Trasferimento del DNA dal gel alla nitrocellulosa Nitrocellulosa incubata con DNA radioattivo, cDNA come sonda che riconosce e lega la banda di DNA Autoradiogarfia

46 Schema trasferimento e ibridazione